Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

この手順の全体的な目的は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）からTリンパ球を生成し、その特性を解析することです。iPS細胞は、OP9-DL1培養系を用いてin vitroで分化させ、その後、Rag欠損マウスを用いてin vivoで成熟させることができます。あるいは、細胞を遺伝子工学的に操作してOT-1 TCRを過剰発現させ、in vivoでの発達のために養子移入させることも可能です。

6週間のin vivo分化後、マウスにEEG seven腫瘍細胞を腹腔内投与してチャレンジを行い、iPS細胞由来T細胞の抗原特異性を評価できます。最終的に、iPS細胞は従来型T細胞と抗原特異的T細胞の両方に分化可能であり、後者は腫瘍チャレンジから動物を保護することができます。この手法の意義は、個別の癌免疫療法への応用にまで及びます。

この手法により、最小限の患者の血液または皮膚組織から、大量の腫瘍反応性T細胞を生成することが可能です。0日目に、20% FBS含有α-MEM培地を用いて、合流したOP9-DL1細胞の単層を含む100 mm培養皿に5×10⁴個のiPS細胞を播種します。5日目に、トリプシン処理を行います。その後、細胞を新鮮な100 mm培養皿で37℃のインキュベーター内で30分間インキュベートし、遠心分離します。20% FBS含有α-MEM培地およびマウスFlt3リガンドを用い、OP9-DL1細胞の単層を含む新しい100 mm皿に、浮遊細胞のうち5×10⁵個を播種します。8日目に、緩く付着している細胞をピペッティングで優しく回収し、遠心分離した後、合流したOP9-DL1細胞でコートされた6ウェル培養プレートの1ウェルに細胞を移します。細胞を37°C、5% CO₂条件下でさらに2週間インキュベートします。22日目に。

分離したiPS細胞を新しい培養皿に入れ、新鮮な培地で37°Cで30分間インキュベートします。次に、浮遊細胞の約半分を取り除き、70 µmのナイロンストレーナーに通して細胞塊を除去し、得られた単一細胞懸濁液を冷PBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、細胞を1.5 × 10⁷ cells/mLの濃度になるようPBSで再懸濁し、静脈内投与まで氷上で保持します。

4週齢のrag欠損マウスを赤外線ランプの下に置き、尾静脈を拡張させます。次に、26.5ゲージの針を装着した1mLシリンジに200µLの細胞懸濁液を満たし、拡張させた尾静脈から細胞を養子移入します。3週間後、養子移入したマウスが安楽死したことを確認し、組織を機械的に破砕した後、リンパ節と脾臓を回収します。

CK溶出バッファーを用いて単一細胞懸濁液を溶解し、得られた単核球を冷PBSで2回洗浄します。その後、細胞表面マーカーで染色し、0日目にフローサイトメトリー解析で細胞を評価します。1日目に、JAMA遺伝子導入試薬を用いて、プレートに播種したPlate Eパッケージング細胞にOT1-MIDRをオーバーナイトで導入します。2日目に、0.1%ゼラチンでプレコートした24ウェルプレートの1ウェルに1×10⁶個のiPS細胞を播種します。Plate E細胞から擬似ウイルスを含む上清を回収し、遠心分離後、0.4 µmフィルターに通して潜在的な不純物を除去します。ポリブレン存在下で、32°C、330 ×gで1時間、細胞を導入します。

導入手順を繰り返した後、同温度で一晩インキュベートします。4日目に導入されたiPS細胞をトリプシンで処理し、ペレット化した後、細胞を新鮮な培地で再懸濁し、あらかじめコーティングされた照射済みsnl 7 6 7フィーダー細胞上に播種します。導入細胞がコンフルエントに達したら、フローサイトメトリーを用いてGFPおよびDsRedのダブルポジティブ細胞を分取します。

iPS細胞の養子移行から6週間後、腫瘍負荷の50日目に、同一マウスの腹腔内に50 µLのEEG-7腫瘍細胞を注入します。Miltenyi Biotec社のCD8陽性T細胞分離キットを用いて、養子移行を行った動物の脾臓およびリンパ節からCD8陽性T細胞を分取します。単離したCD8陽性T細胞を、ナイーブなC57BL/6Jマウス由来の照射済み脾細胞と1:10の比率で混合し、0.5 µmol/mLのOVAで40時間共培養してパルスします。

その後、さらに4時間、細胞にfelden Aを添加します。最後に、フローサイトメトリー分析により細胞集団を評価します。naive C 57 black six JマウスからSP細胞を分離した後、細胞懸濁液を2つのグループに分けます。

CFSE high群を5 µM/mLのCFSEでラベルし、10 µg/mLのovaペプチドで1時間パルスし、CFSE low群を0.5 µM/mLのCFSEでラベルし、パルスは行わない。PBS中で、2.5 × 10⁶個のCFSE high細胞と2.5 × 10⁶個のCFSE low細胞を混合する。その後、フローサイトメトリーにより細胞のCFSE発現を解析する。

対象のマウスに養子転送を行ってから16時間後、腫瘍チャレンジの20日目に腹腔内腫瘍細胞数を測定します。18.5ゲージの針を装着した10 mLシリンジと冷PBSを用いて、腹腔を洗浄します。回収した腫瘍細胞を計数し、腫瘍浸潤細胞を同定します。

腫瘍チャレンジの後期段階で腫瘍を摘出し、その後、腫瘍を3等分に切断します。1つ目の腫瘍片をクライオバイアルに入れ、バイアルをドライアイスの上に置きます。2つ目の腫瘍片は直ちにホルムアルデヒドで固定します。

凍結保存した組織切片を風乾させた後、条件付け済みのRPMI 1640培地中で3枚目の切片を保存します。固定した切片をさらに15分間風乾させた後、冷 acetone 中で15分間固定します。その後、PBSで5分間スライドを洗浄します。

スライドを湿潤チャンバーに入れ、非特異的結合をブロックするため、組織切片に3% B, SAおよびPBSを30 µL添加し、30分間静置します。その後、ブロッキングバッファーをブロットオフし、3% PSA含有PBSで希釈したpe anti TCR RV alpha two抗体とfitzy anti ova抗体の混合液50 µLを用いて、湿潤チャンバー内で2時間、組織切片をインキュベートします。インキュベーション終了後、スライドを冷PBSで3回洗浄します。最後に、腫瘍浸潤T細胞のフローサイトメトリー解析のための蛍光顕微鏡観察を行う前に、水溶性封入剤で切片を封入します。

腫瘍を押し潰して単一細胞懸濁液にします。次に、特定の表面マーカーについて細胞を解析します。T細胞のマーカーとしてCD3およびTCRβを用い、NotchリガンドDL1によるiPS細胞の刺激がT細胞への分化に寄与するかを検討しました。CD3陽性かつTCRβ陽性のiPS細胞由来細胞におけるCD4およびCD8の細胞表面発現を評価しました。

右側のドットプロットは、in vitroでiPS細胞から分化誘導された、22日目のCD3陽性TCR β陽性CD4陰性CD8陽性のシングルポジティブT細胞を示しています。さらに、前図のiPS細胞由来シングルポジティブ細胞は、プレートコートした抗CD3抗体および可溶性抗CD28抗体でin vitro刺激した際にインターロイキン2およびインターフェロンガンマを産生し、受容マウスへ養子移殖した後のiPS細胞由来T細胞が機能的であることが確認されました。TCR遺伝子を導入したiPS細胞の大部分はCD8陽性CTLへと分化し、プールしたリンパ節および脾臓細胞を用いたこれらのドットプロットにおいて、ペプチド刺激に対しインターロイキン2およびインターフェロンガンマを分泌することでin vitroで応答しました。

TCRを導入したiPS細胞を養子移入したマウスでは、CD8陽性Vβ5陽性T細胞が生成されましたが、コントロールを導入したiPS細胞では生成されませんでした。CD8陽性Vβ5陽性集団において、インターロイキン2およびインターフェロンガンマ産生の細胞内サイトカイン染色が陽性であり、これはシェーディングされたアイソタイプコントロールのヒストグラムと比較して、これらのヒストグラムの濃い線で示されています。これにより、iPS細胞由来のCTLが機能的であることが示されました。これらのデータは、iPS細胞移入の10週間後、またはOT-I CTL移入の1日後にマウスに注入された、エペプチドでパルスしたCFSE high細胞（各グラフの右側のピーク）およびCFSE lowコントロール細胞（左側のピーク）を示しています。

抗原特異的なiPS細胞由来CTLは抗原刺激に応答し、ここでCFSE high細胞が消失していることから、細胞傷害活性を有することが示されました。OT-I TCR遺伝子を導入したiPS細胞をC57BL/6マウスに養子移入し、その後EEG7腫瘍細胞でチャレンジを行いました。20日目に腹腔内の腫瘍細胞数を計測しました。コントロール群と比較して、TCR導入iPS細胞を投与したマウスでは、腫瘍細胞数が有意に減少していることに注目してください。

最も重要な点として、TCR導入iPS細胞の養子移殖により、過剰反応するCTLの腫瘍組織への浸潤が誘導され、腫瘍チャレンジから動物が保護されたことが、腫瘍チャレンジ後30〜35日に回収した腫瘍組織のH&E染色で示されています。TCR導入細胞またはOT-I CTLを養子移殖したマウスの腫瘍ではこの浸潤が見られましたが、擬似注入（mock injection）群やコントロール群では見られませんでした。ここにある赤色の矢印で示されているように、導入細胞には炎症細胞が浸潤していました。赤色で示されたOva特異的Vα2陽性CTLが、緑色で示されたOva発現腫瘍組織に浸潤していることが確認されました。

この図において、対照群のマウスにおける腫瘍では腫瘍浸潤細胞が少ないか、あるいは認められませんでしたが、腫瘍組織からの単一細胞懸濁液をフローサイトメトリーで解析し、CD8陽性集団をゲートした後にVα2陽性とVβ5陽性の発現を分析しました。TCRを導入したiPS細胞を養子移植したマウスの腫瘍組織では、腫瘍浸潤細胞が最も高いレベルで認められたのに対し、対照的な導入iPS細胞を投与したマウスの腫瘍では、ova特異的CD8陽性T細胞の浸潤は見られませんでした。

このビデオを視聴することで、iPS細胞から抗原特異的T細胞を生成する方法、およびiPS細胞由来T細胞の機能を評価する方法について、十分に理解できるはずです。