プラナリアの固定化、部分照射し、組織移植

本実験の目的は、再生中の幹細胞およびその娘細胞の挙動をin vivoで解析するため、プラナリア内の幹細胞除去組織に隣接して健全な幹細胞集団を配置することである。これは、非照射または葉状に照射したプラナリアを麻酔して固定し、さらなる操作を可能にすることで達成される。次に、固定した非照射プラナリアの一部を鉛で遮蔽し、X線照射を行う。これにより、幹細胞が除去された組織と、遮蔽され幹細胞が保持された組織が隣接した、外傷のないプラナリアが作製される。

あるいは、非照射のドナーから採取した組織片を、事前に照射したホストに移植することで、幹細胞が消失したホスト内に孤立した幹細胞集団を持つ個体を作製することも可能です。幹細胞が消失したホストにおいて、幹細胞マーカー遺伝子のホールマウントRNA in situ ハイブリダイゼーションを行った結果、幹細胞消失組織に隣接して孤立した幹細胞集団が存在することが確認されました。

本稿で述べる手法は、移植パラダイムと部分放射線照射パラダイムの両方を用いて幹細胞の挙動を研究することにより、プラナリアの再生をより深く理解することを目的としています。これにより、周囲の組織や幹細胞が存在する局所環境が、これらのネオブラストまたは幹細胞の挙動に影響を与えるかどうかを検証することが可能になります。再生プロセスの間、実験の1〜2か月前から、付属の原稿に従ってプラナリアに給餌します。本デモンストレーションで目的とするサイズを得るために、体長1〜2 cmで幅2 mm以上のプラナリアを選択します。

その後、使用する3～7日前から絶食させます。次に、0.1～0.2%（w/v）のクロトンを純水に溶解し、軽度の局所麻酔剤であるクロトン溶液を調製します。その後、溶液を氷上で冷却します。組織移植のため、ブンゼンバーナーを用いて、内径0.75 millimeterのキャピラリーチューブの端から1～2centimeterの位置を90度の角度に曲げ、移植組織を切り出すための器具を作成します。

次に、外径0.7 millimeterの別のキャピラリーチューブの端から1〜2centimeterの位置を90度に曲げ、ホストにグラフト受容用の穴を作成するための器具を用意します。続いて、付属の原稿に記載されたサイズに従って、黒色のWhatman No.3フィルターペーパー、Kimwipe、および巻紙を切断します。

その後、修飾Holt Fers溶液およびCaine飽和Holt Fretter溶液を調製します。両溶液を4 °Cまで冷却します。次に、折りたたんだキムワイプをパラフィルムの正方形に貼り付けます。

解剖顕微鏡下で、それをペルチェ冷却プレートまたはその他の冷却装置の上に置きます。続いて、冷やしたHolt Fretter溶液でキムワイプを十分に湿らせます。その後、キムワイプの上に2枚の黒色のフィルターペーパーの長方形を置きます。

次に、Whatman No.2 ろ紙をシャーレに置きます。ろ紙に Holt Fretter 溶液を浸して湿らせます。その後、部分照射を行うため、シャーレを氷上で冷却します。

組織移植と同様に、大きめのディッシュに大きめのペーパーライナーを配置します。フィルターペーパーをHolt Fretter溶液で湿らせます。その後、ディッシュを氷上で冷却します。

この手順では、ペトリ皿に冷却したクローネ溶液を満たします。移植させるため、プラナリアをピペットで皿に移します。麻酔をかけるホストとドナーは、一度に1個体ずつとしてください。

部分的照射を行う場合、多くの個体を一度に麻酔することが可能です。その後、個体が動かなくなるまで、クローネ溶液に5～10分間浸します。冷やしたHolt Fretter溶液を満たしたディッシュにピペットで移し、個体を洗浄してください。

その後、冷やしたHolt fretter溶液を飽和させた黒色フィルターペーパー上にピペッティングし、plin領域を固定します。次に、ピンセットを用いて腹側を下にして配置します。ここで、あらかじめアイスバケットで冷却しておいた、トップソースX線照射装置に適合する Petri dish を準備します。

黒いフィルターペーパーを動かして、麻酔をかけたプランエリアをペトリ皿の中で整えます。その後、それらを上部の線源X線照射装置へ移し、陰極管からプランエリアまでの距離が最小になるように氷バケツを配置します。これにより、実効線量率を最大化します。

次に、X線照射のため、パリアと陰極管の間に鉛遮蔽体を配置します。遮蔽されていない領域から完全に幹細胞を消失させたい場合は、30 grays以上の線量を照射します。X線照射直後、パリアを冷却したパリア水に移動させてください。

その後、パリアン水を室温まで温め、動物が黒色フィルターペーパーから自力で離れるまで待ちます。これで部分照射の手順は完了です。解剖顕微鏡下でこの手順を開始するには、ペルチェ素子または冷却プレートで事前に冷却したキムワイプの上に、麻酔をかけたホストとドナーのプランエリアをそれぞれ別の長方形の黒色フィルターの上に配置します。

内径0.75 mmのキャピラリーチューブを用いて、ドナーからグラフトプラグを切り出します。次に、ピンセットを使用して、それをホストの邪魔にならない部位に配置します。その後、外径0.7 mmのキャピラリーチューブを用いて、ホストからプラグを除去します。

続いて、孔にグラフトを配置します。長方形の黒色フィルターペーパー上の移植宿主を、あらかじめ準備したペトリ皿に移します。巻紙の一片を、Caine飽和Holt Fretter溶液で湿らせます。

次に、それを移植したホストの上に置きます。続いて、飽和Holter溶液を含浸させたフィルターペーパー4枚を用意し、移植したホストが沈下した場合には、飽和Holt Fretter溶液を含浸させたカット済みのキムワイプ4個を用意します。これらをフィルターペーパーの上に重ねて配置します。

その後、蓋を閉めます。シャーレを氷上に置きます。次に、ドナーパーリアンを回復と再生のためにパーリアン水へと移します。

すべての移植が完了したら、移植したparianを10 °Cのインキュベーターで一晩置きます。翌朝、parian waterを満たしたペトリ皿に移します。parianがフィルターペーパーから自然に剥がれるのを待つか、ピンセットで慎重に取り除き、その後は2〜3日ごとに一度parian waterを交換してください。

放射線照射後3日目に固定した、照射済みだが完全に遮蔽されたコントロールのparianにおけるホールマウントin situハイブリダイゼーションでは、野生型parianと区別がつかない幹細胞分布が示されています。一方で、前方および後方を露出させて部分的にのみ遮蔽したparianでは、非遮蔽領域から幹細胞が消失しているように見えます。ここでは、移植に成功したparianの背面および腹面の図を示します。

移植から3日後、移植片は背面と腹面の両方で明確に確認でき、移植片と宿主の境界界面は特徴的な非色素組織に囲まれています。一方、移植に失敗した場合は、移植部位に目に見える移植組織は認められません。ホールマウントin situハイブリダイゼーションにより、幹細胞が移植部位内またはその周囲にのみ存在することが明らかになり、手法を習得すれば移植が成功したことを示します。

移植はそれぞれ最短5分で完了でき、成功率は90〜100%に達します。また、照射装置の照射野が十分に広いと想定すれば、部分照射の規模を大幅に拡大することが可能です。