ドーパミン作動性ニューロンの開発における遺伝子機能を研究するためのニワトリ中脳でのOVOエレクトロポレーションに

本実験では、外来遺伝子の発現が中脳の発達およびドパミン作動性ニューロンの分化に及ぼす影響を調べるため、ニワトリ中脳へのin ovoエレクトロポレーション法を実演します。まず、ハンバーガー・ハミルトン（Hamburger Hamilton）ステージ11のニワトリ胚の中脳に、目的のプラスミドDNAを注入し、発達中の中脳胞へ外来DNAを特異的に導入します。次に、特製の小型電極を用いて中脳胞にエレクトロポレーションを行い、外来DNAを中脳の神経前駆細胞へ特異的に導入します。

次に、中脳で良好なM cherry発現が見られるステージ23の胚を回収し、最適な中脳横断切片を作成します。最終的に、チロシン水酸化酵素などのドーパミン作動性ニューロンマーカーを用いた免疫染色解析を行うことで、目的遺伝子の発現によって誘導された神経前駆細胞から成熟ドーパミン作動性ニューロンへの分化を確認することができます。in ovo electroporationの他の既存手法に対する本手法の主な利点は、本プロトコルにより膜特異的なエレクトロポレーションが可能となり、中脳ドーパミン作動性ニューロンの分化を研究できる点にあります。

この手法は中脳の発達に関する知見を得るのに有用ですが、神経系の他の部位における運命マップ分析や、遺伝子発現の制御に関する研究にも適用可能です。ハンバーガー・ハミルトン期ステージ11の胚を得るために、各受精卵を横向きに配置し、上部に鉛筆で印を付けます。その後、トレイをあらかじめ加温した加湿インキュベーター内のロッカースイングに設置します。

受精後41時間目に、24時間ごとに湿度と水位を確認します。卵をインキュベーターから取り出し、室温で保存します。各卵の表面を70% ethanolで洗浄し、拭き上げます。

次に、2枚の4 cmのセロハンテープを卵の上に並べて貼り、鉛筆の印の上に大きな長方形を作ります。テープを卵に密着させ、窓枠を固定します。18ゲージの針を装着した10 mLシリンジを用いて、胚を刺激したり傷つけたりしないよう、針を卵黄から遠ざける方向に傾けて卵殻を貫通させます。

卵から5 mLのアルブミンを吸引します。針を70% ethanolで洗浄してください。次の卵を穿刺する前に、針を乾燥させます。

flaming brown マイクロピペットプラーの設定を入力します。次に、P 10 ピペットを用いて、薄壁キャピラリーチューブを注入針に引き伸ばします。ロングチップキャピラリーピペットチップに 5 to 10 µL のプラスミド溶液を吸い取ります。

次に、気泡が入らないように、ガラス針に溶液をゆっくりと連続的に充填します。充填した針を、マイクロマニピュレーターとマイクロインジェクターに取り付けられたニードルホルダーに装着します。続いて、解剖顕微鏡下で、針をより明確に視認するために背景を暗くし、緑色の液体が止まっている箇所でスプリングシザーを用いて針をカットします。

前の針穴から、直径2〜2.5 cmの窓を開けます。これは白出（アルブミン）を抽出するためです。卵を片手で回転させながら切断してください。

卵を処理するごとに、70%エタノールに浸したキムワイプでハサミを拭き取ってください。解剖顕微鏡下でヒヨコ胚を観察します。必要に応じて、ヒヨコ胚の下に0.22 µmフィルターを通した20%インディアインク（PBS溶液）を注入し、胚を可視化します。胚の頭部を針から遠ざけるようにして、針の進行方向と平行に胚を配置します。

中脳後脳境界部にて、神経管を45度の角度でゆっくりと貫通させます。pico spritzer マイクロインジェクターを用い、注入時間を25ミリ秒に設定して注入を開始します。針の先端の状態に応じて時間を調整し、Fast Green染料を含むプラスミドDNAを、中脳に相当する神経胞にのみ満たします。

注入針を回収した後、胚の上にペンストレプト溶液を3滴滴下します。効率的なエレクトロポレーションを行うため、B-T-X-E-M-C eight 30 electroporの設定を確認してください。腹側中脳の位置において、神経管の底部と同じ水平レベルに、カスタムメイドの小型L字型白金電極を配置し、胚の中脳が2つの電極の中央に位置するようにします。

BTXフットスイッチを1回押し、電極周辺に気泡が発生することを確認します。電気穿孔が成功するたびに、電極を卵から慎重に抜き取り、電極を拭き取ります。70% ethanolを浸したケムワイプを用いて、胚の上にペニシリン・ストレプトマイシン溶液をさらに3滴滴下します。

次に、5 cm × 5 cmの透明な梱包用テープで窓を覆います。卵の内容物に触れないようにして卵をしっかりと密封し、ターンテーブルをオフにした状態で卵をインキュベーターに戻します。目的の段階に達したら、条件ごとに、生存している胚をPBSを満たした共通のペトリ皿に回収します。

次に、蛍光解剖顕微鏡を使用します。回収した胚をスクリーニングしてm cherryの発現を確認し、陽性胚を24ウェルプレートの個々のウェルに転移させます。各ウェルに、調製したばかりの2%パラホルムアルデヒド1 mLを加え、4 °Cで3時間インキュベートします。

固定した胚をPBSで3回洗浄し、平衡化して同期するまで15% sucroseに浸します。同様の平衡化を30% sucroseで繰り返し、その後、各胚をOCTに包埋します。その後の解析のために最適な中脳横断面が得られるよう、胚を適切に配向させてください。

胚鶏のin ovoエレクトロポレーションアッセイhhにおける後続解析のため、厚い中脳の18 µm厚のクライオスタット切片を調製します。ステージ11の鶏胚に、m cherry蛍光マーカーと目的遺伝子を含むプラスミッドカクテル、および注入プロセスの追跡用のfast green染料を注入します。中脳へのエレクトロポレーション後、胚をさらにインキュベートし、m cherry陽性の胚を回収して、固定および包埋を行います。

次に、中脳の凍結切片を作製します。注入および電気穿孔が成功したニワトリ胚において、チロシン水酸化酵素などの中脳マーカーを用いた免疫染色によりサンプルを解析します。さらに発生させた後、m cherryの発現を注入マーカーとして用いることで、通常、中脳領域にm cherryの発現が認められます。

m cherryが適切に発現している胚を固定、包埋し、中脳の凍結切片を作成するために方向を調整します。ここでは、m cherryおよびflagタグ付き遺伝子と、ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるチロシン水酸化酵素との共局在により、エレクトロポレーションした神経前駆細胞におけるドーパミン作動性運命の決定を検討します。このビデオを視聴することで、中脳領域への特異的なDNAコンストラクトの注入方法や、小型のカスタム電極を用いたエレクトロポレーションのピンポイントな実施方法を含め、胚の中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞への遺伝子発現を領域的に限定する方法について十分に理解できるはずです。

RNI媒介のロックダウンや、レポーター遺伝子に連結したエンハンサーの発現などの他の手法を用いることで、神経系の特定の領域や細胞型における遺伝子機能や遺伝子調節を研究することが可能です。