ラットの脾細胞からT細胞増殖因子の準備

こんにちは、クリスティン・ビートンです。私はカリフォルニア大学アーバイン校生理学・生物物理学部のジョージ・チェン研究室で助教として研究に従事しています。これから2日間かけて、T細胞成長因子（TCGF）の調製方法について解説します。

日常的な細胞培養において、培地中のサイトカイン組成を正確に把握する必要がない場合は、T細胞増殖因子（TCGF）を使用します。これは、T細胞の増殖に必要なサイトカインを含む脾臓細胞培養の上清です。TCGFの調製方法は、まず健康なLewisラットを安楽死させて脾臓を摘出し、単一細胞懸濁液を調製します。その後、溶血させて赤血球を除去し、得られた単核細胞をコンカナバリンA（Con A）で刺激することで、T細胞に増殖に必要なあらゆるサイトカインを産生させます。TCGFを生成するには、このように細胞を活性化させる必要があります。

本手法では、レクチンであるConcanavalin A（略称：Con A）を細胞培養液に添加します。Con Aを細胞培養液に添加すると、糖鎖付加されたT細胞受容体複合体に結合し、同時に複数の複合体に結合することで、「キャッピング」と呼ばれる現象が起こります。これにより、細胞表面のすべての受容体が凝集してクラスターを形成し、Tリンパ球に活性化信号が誘導されます。

細胞が活性化されると、ブラスト変換が起こります。つまり、細胞が肥大化し、サイトカインの分泌が始まります。当初、TCGFの正体は主にインターロイキン2であると考えられていましたが、現在では必ずしもそうではないことが分かっています。

また、これにはインターフェロンガンマ、TNFアルファ、そしておそらく培養後48時間、細胞を生存させるために最低限必要なごく少量のサイトカインも含まれています。細胞は、我々に必要なすべてのサイトカインを産生しました。そこで、細胞を除去します。細胞を除去して上清のみにした状態でも、上清中にはまだ遊離コニアルが含まれています。これは問題となります。なぜなら、T細胞株を増殖させるためには、T細胞増殖因子を使用したいからです。

また、コンカナバリンAを遊離状態でそのままにしておくと、意図しないタイミングで細胞が活性化されてしまいます。この問題を回避するために、遊離しているすべてのコンカナバリンAに結合する糖を過剰に添加します。これにより、コンカナバリンAは完全に不活性化され、培養系にTCGFを添加した際に細胞上の他の糖鎖修飾受容体に結合することがなくなります。

それでは始めましょう。本実験の最初のステップは、安楽死させた直後のラットから脾臓を摘出することです。今から滅菌器具を用いて、速やかに摘出を行います。

脾臓を取り出した後、抗生物質を添加したPBSに浸します。抗生物質にはペニシリンとストレプトマイシンを使用します。それでは、始めていきましょう。まず、培養物のコンタミネーションを防ぐため、ラットに70% ethanolをスプレーします。

次に器具を用いて、こちらの皮膚を小さく切開します。続いて筋肉の層を取り除くと、ここに脾臓が現れます。別のピンセットを使い、脾臓を傷つけないように注意しながら、ゆっくりと摘出します。

このように結合組織を取り除きます。これで脾臓が取り出せました。もちろん、腹腔内の他の部位を傷つけないよう細心の注意を払います。腸管を傷つけると、すぐに脾臓が汚染されてしまうためです。

次に、摘出した脾臓をPBSと抗生物質を含むチューブに移します。このチューブは氷上に保持します。これで、3匹のラットから脾臓を採取しました。

それでは、これらの脾臓から単一細胞懸濁液を調製します。脾臓を準備したので、組織培養フードに移動し、70 µmのセルストレーナーを用いて単一細胞懸濁液を調製します。脾臓から単一細胞懸濁液を作成するために、いくつかの器具と試薬が必要になります。

滅菌済みの器具として、ピンセット1本とハサミ1本を用意します。次に、滅菌済みの1 mLシリンジのプランジャーをシャーレに入れます。脾臓を抗生物質添加PBSに入れます。

別のシャーレには、10 mLのPBSおよび抗生物質を入れた70 µmのセルストレーナーを用意しました。最初のステップは、脾臓がきれいな状態であることを確認することです。ここでわかるように、まだ結合組織の小さな破片が残っているため、これらはセルストレーナーをすぐに詰まらせてしまうので取り除きます。そのために、不要な部分を切り取り、シャーレの蓋の中に捨てます。

脾臓の洗浄がほぼ完了しましたので、脾臓を一つずつセルストレーナーに入れ、細かく刻みます。その後、3つすべての脾臓を混ぜ合わせます。次のステップは、単一細胞懸濁液を作製することです。もちろん、すべてを無菌状態に保つ必要があるため、セルストレーナーには一切触れず、滅菌済みの1 mLシリンジのプランジャーを使用して、脾臓の断片をセルストレーナーに通します。

セルトレーナーの外側でご覧いただけるように、単一細胞懸濁液を作成しています。初回ですので、まだ脾臓の小さな断片がいくつか残っていますが、すでに単一細胞懸濁液を回収し始めています。回収した懸濁液は、氷上に保管してある50 mLチューブに転送済みです。

さらに、セルストレーナーにPBSおよび抗生物質溶液を10 mL追加します。PBSおよび抗生物質溶液を約10 mL用意します。洗浄工程であるため、厳密に10 mLである必要はありません。これをセルストレーナーに加え、同様の手順で操作します。

シリンジのプランジャーに戻り、さらに少しずつセルストレーナーに押し出します。結合組織や、除去しきれなかった小さな脂肪片がセルストレーナーに残るため、当然ながらすべてを押し出すことはできません。しかし、脾臓の大部分をセルストレーナーに移すことができるはずです。

その後、先ほど行った手順を正確に繰り返します。単一細胞懸濁液を回収し、同じ歯に添加します。この時点で、セルスクリーナー内にはスクリーンからの残渣がほとんどなく、流出するPBSはかなり澄んでいます。もう一度洗浄を行うだけで、ほとんどの細胞が回収されるはずです。

PLE細胞の単一細胞懸濁液が準備できましたので、ペレットを作るために遠心分離を行います。8〜10分間の遠心分離で十分です。これでPLE細胞の遠心分離が完了し、きれいなペレットが得られました。

次に、上清を除去し、赤血球を溶血させます。筋細胞を0.15 Mの塩化アンモニウム溶液に懸濁させます。脾臓1個あたり5 mLを使用します。

脾臓を3個使用するため、塩化アンモニウムを15 milliliters使用し、氷上で操作を行います。赤血球を溶血させるため、3分間緩やかにピペッティングします。それでは、露出を高めたこちらのテイクを使用します。

これで電細胞の解析を3分間行いました。次に、チューブにPBSを満たします。培地を使用しても構いません。これは、溶液の浸透圧を細胞にとっての正常範囲に戻すためです。

前回と同様に、細胞をペレット化させるために8〜10分間遠心分離します。その後、抗生物質を含む同一のPBSを用いて2回洗浄します。これで、エレクトロサイトを溶解させた後に細胞を遠心分離しました。なお、エレクトロサイトが100%放出されることはないため、その点については懸念しないでください。

したがって、ペレットは依然として赤色ですが、上清はより透明になります。次に、上清を除去し、ペレットを再懸濁させてからPBSを50 mLまで加え、遠心分離を行います。この工程をもう一度繰り返し、計2回の洗浄を行います。その後、細胞数を計測します。心筋細胞を2回洗浄し、培地で懸濁させた後、自動細胞計数装置を用いてカウントしました。

予想通りです。3つの脾臓から約600 million cellsが得られました。通常、1つの脾臓から200 to 250 million cellsが得られるため、これは妥当な結果です。そこで、10% fetal calf serumを添加した培地を用い、2 million cells/mLの密度で細胞を播種します。

そして、その培地に細胞を刺激するためのConc Aを2 µg/mL添加します。その後、細胞をインキュベーターに入れ、48時間培養します。細胞を48時間インキュベートした結果、ご覧の通り、良好に増殖しました。

培地がオレンジ色に変化しました。これでTCGFの調製を完了させる準備が整いました。既にご承知の通り、細胞を活性化させるために細胞懸濁液にcon carnavalを添加しています。

したがって、コンカナバリン A はレクチンです。これは T 細胞のすべての受容体上の糖に結合し、それらすべての細胞を人工的に活性化させます。現在問題となるのは、細胞上清の中に依然としてコンカナバリン A が一部残っていることです。

また、他のT細胞培養において細胞を増殖させるためにスナットを使用するため、それらの細胞培養中にコンカナバリンAが存在することは望ましくありません。したがって、これを除去するために、コンカナバリンAが結合する過剰の糖である、ここに示しているメチルα-D-マンノピラノシドを添加します。この糖を過剰量加え、完全に溶解させます。

これにより、残りのすべてのconc navalが結合します。それが完了したら、細胞培養上清をステリルフイルターでろ過し、今後数週間から数ヶ月で使用するために分注して冷凍保存します。それでは、この最終ステップを開始しましょう。まず、細胞を除去するために遠心分離ができるよう、細胞培養上清を50 mLチューブに加えていきます。

したがって、必要な数のチューブに充填しますが、これは培養フード内では行いません。フード内で行うことも可能ですが、最終的に非滅菌の糖を添加するため、溶液をろ過する必要があるため、単純にベンチ上で行います。その方が簡単です。これで、すべての細胞と上清を50 mLファルコンチューブに分注しました。

それでは、これらを遠心機にかけ、約10分間遠心分離します。遠心分離を行う唯一の理由は、細胞をペレット化して上清を透明にするためです。細胞が沈殿し、上清が透明になりましたので、これを回収します。

そこで、すべての上清を清潔な150 cm²のフラスコに回収します。そして、このフラスコに糖を加えます。細胞を遠心分離している間に、上清 1 mL あたり 15 mg になる量の糖を量り取りました。

完全に溶解させ、その後、上澄み液を滅菌ろ過します。ここで、上澄み液1 mlあたり15 mgの糖を加えます。キャップを戻します。滅菌条件下で作業していないため、キャップの中に液が入っても問題ありません。糖がすべて溶解するまで混ぜ合わせます。

すぐに終わるはずです。はい、糖はすべて溶解しました。あとは上清を滅菌フィルターでろ過し、分注するだけです。

通常、10〜15 mLずつ分注し、-20°Cで保存します。このように分注したものは数ヶ月間保存可能です。TCGFを冷蔵庫で保存することもできますが、その場合は10〜15日以内に使用してください。

ここ2日間で、T細胞増殖因子の調製方法について説明してきました。この上清は非常に簡単に、かつ安価に調製することができます。そのため、高価なサイトカインカクテルを購入することなくT細胞株を培養し維持するために、当研究室では頻繁に使用しています。皆様の実験の成功をお祈りしています。