のカスタマイズアスペルギルスニジェールモルフォロジー

本手法では、糸状菌であるAspergillus nigerのマイクロ粒子依存的な形態構造を生成および特性評価し、菌類の形態と生産性の相関関係を明らかにします。比生産性を算出するため、3リットルの撹拌タンク型バイオリアクターを用い、マイクロ粒子の有無がある状態でA. nigerを72時間培養します。規定の時間にサンプルを採取し、バイオマス乾燥重量およびβ-fructosidase活性を測定します。

72時間後、顕微鏡を用いて真菌の形態を観察し、デジタル画像解析によって特性を明らかにします。次に、画像解析の関連パラメーターを統合して、比生産性と数学的に相関する形態数（morphology number）を算出します。最終的に、この手法により、Aspergillus nigerの形態を精密に生成し、包括的に特性評価することができ、糸状微生物の形態形成に関する理解を深めることが可能になります。

Aspergillus nigerは、数十年にわたりバイオテクノロジーにおける重要な工業的利用菌として活用されてきました。A. nigerおよび近縁種の最も興味深く、かつ制御が困難な特性の一つに、培養条件に応じて緻密な球状ペレットから粘性の高い菌糸体まで変化する複雑な形態学的な特徴があります。本手法の主な利点は、微粒子を添加することで、プロセスのニーズに合わせて真菌の形態を特異的に調整できるようになった点にあります。

これまで、このような真菌形態のカスタマイズに関する手法は他に報告されていません。本手法は、糸状微生物の培養に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。産業応用においては、真菌の形態を制御すること、また、生産性の高い形態と低い形態を区別することが極めて重要であるためです。

本プロトコールでは、真菌の形態を自在にカスタマイズし、特性評価を行うための手法を提供します。この手法は Aspergillus niger の形態に関する知見を得るのに有用ですが、Penicillium や Streptomyces などの他の糸状微生物にも適用可能です。付属のプロトコールの詳細に従い、滅菌培養用に4台のバイオリアクターを準備してください。

マイクロ粒子の添加に基づき、形態の異なるAspergillus nigerを培養します。72時間後、培養液のサンプル50 millilitersをFalconチューブに移します。

バイオマス試料は、デシケーターで乾燥させた後、少なくとも2連（デュプリケート）で採取します。マイクロ天秤を用いてセルロースフィルターの重量を測定します。フィルターを、ウォータージェット真空ポンプに接続されたブフナー漏斗にセットします。試料10 mLをろ過し、続いて10 mLの脱イオン水を流してバイオマスから培地成分を除去します。フィルターの中央を一度折り曲げます。

それをガラス製のシャーレに入れ、恒量になるまで定温乾燥機で乾燥させます。フィルターをデシケーターに移し、冷却させます。その後、重量を測定します。

グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ酵素アッセイにおいて、重量の測定、フィルターの重量差の算出、およびその後のサンプル量による除算により、1リットルあたりのバイオマス乾燥重量を算出します。サンプルは1.5 mLのシリンジパスを用いて氷上で保存します。培養懸濁液をアセテートセルロースフィルターでろ過して反応チューブに入れ、β-フルクトシダーゼアッセイを行います。

統計的な堅牢性を確保するため、2つのトリプリケートサンプルを用いて慎重に試験を行います。アッセイを開始するには、テストチューブに20 µLのサンプルを加えます。pHおよび温度に依存するスクロースからグルコースへの分解を制御するため、20 µLのサンプルの代わりに20 µLの脱イオン水を使用してください。また、各サンプルについて、アッセイにより培養液中の残留グルコースのネガティブコントロールを準備します。

熱不活化したサンプル 20 µL。スクロースからグルコースへの反応を開始させるため、1.65 M スクロース溶液 200 µL を加える。pH 5.4 のサンプル 20 µL に対し、すべての反応チューブを 40 °C のヒーティングブロックで 20 分間インキュベートする。チューブを氷上で冷却した後、95 °C で 10 分間加熱して反応を停止させる。

必要に応じてサンプルを遠心分離し、測定される吸光度が校正値の範囲内に収まるようにアッセイ用にサンプルを希釈します。次に、各反応について、マイクロタイタープレートに2 µLのサンプルを分注します。サンプルの測定はn=3で行ってください。

また、1 mMから15 mMの範囲のグルコース標準溶液を10種類調製し、標準曲線を作成します。ゼロ点校正には、2 µLの脱イオン水を使用します。次に、それぞれに200 µLの試薬溶液を加えます。

室温で10分間インキュベートします。96ウェルSunriseマイクロプレートリーダーおよびMagellanデータ回収ソフトウェアを用いて、450 nmにおける吸光度を測定します。結果のチャートをスプレッドシートで開き、標準曲線の校正線を作成します。

各サンプルの活性を算出します。次に、サンプル活性から適切なネガティブコントロールの値を差し引くことで、β-フルクトシダーゼ活性を算出します。最後に、バイオマス乾燥重量とβ-フルクトシダーゼ活性を考慮して、比生産性を算出します。

3 mLの培養懸濁液をプラスチック製ペトリ皿に入れ、生理食塩水で希釈して形態構造を分離させます。顕微鏡写真の質は極めて重要です。後の画像解析のため、希釈ステップでは細心の注意を払ってください。

カメラ一体型の顕微鏡の下にペトリ皿を設置します。サンプルあたり形態構造の画像を約100枚撮影して保存し、各画像に少なくとも1つのオブジェクトが完全に収まるようにしてください。異なるリアクターからのサンプルを含む皿についても同様に操作し、その都度新しい画像を撮影します。

添加したタルク粉末の量が異なる、異なるリアクターから得られたサンプルの形態的な成長形態の違いに注目してください。次に、画像処理プログラムであるImage Jで、同一サンプルのすべての画像を開きます。プロセスツールを使用して、バイナリ化を行います。

一連の画像すべてにコマンドを適用するため、画像を白黒に変換します。次にマクロコードを使用し、スケールバーを含む画像の一枚を開きます。スケールバーに沿って直線を引いて、2000 micronsに相当するピクセル数を決定します。

解析ツールを選択し、計測設定を行い、形状因子（shape factors）、フェレット径（ferrets）、直径（diameter）、面積（area）、および周囲長（perimeter）を選択します。マクロコードを使用して一連の画像を処理します。次に、形状因子の結果をまとめたスプレッドシートを開きます。

各画像について、1つのサンプルのすべての画像を用いて形態指標（morphology number）を算出します。形態指標の平均値を算出してください。グラフ作成およびデータ解析プログラムを使用して、形態指標と比生産性をプロットします。

タルコ微粒子の濃度を段階的に増加させ、数学的回帰を用いて数学的関係を決定します。Niger SKAN 10 15を8個使用します。標準条件下では期待されるペレット形態が示されますが、形態は真のペレット形態から分散形態、あるいは菌糸状の形態へと変化します。

興味深いことに、培地に10 g/Lのタルク微粒子を添加することで、菌糸形態が形成されます。同時に、Beto Fructo taseの活性は約3倍に増加します。1 g/Lまたは3 g/Lのタルク粉末を添加すると、自動画像解析で決定されたパラメータに基づき、分散した形態となり、フルクトース活性が2倍になります。微粒子依存的な形態は、形態学的に包括的に記述することが可能です。

注記として、滑らかなペレット状の完全な球形粒子は、顕微鏡画像では完全な円として現れます。形態係数の値は、標準条件において1に近づきます。リアクター1における形態は、約0.8の形態係数を示します。

10 g/Lのタルク粉末を用いたリアクター4における形態を示します。タルク粉末の形態数は約0.1です。タルク粉末濃度が1 g/Lおよび3 g/Lであるリアクター2および3の形態数は、これらの中間に位置しており、分散した形態を示しています。

微粒子に依存した形態はβ-フルクトシル転移酵素の生産性と密接に関連しているため、形態、数、および形成後の生産性の間には良好な数学的相関が認められます。この手法は、バイオテクノロジー分野の研究者が菌類の形態、特に生産性との関係をさらに探求するための道を開きました。特定の形態を持つ菌類の交配型を詳細に作成するこの手順に従うことで、糸状微生物培養における他の重要な側面を探索することが可能です。

例えば、菌糸形態は、プレート形態よりも粘性がはるかに高いことが知られています。そのため、目的産物の精製などの問題を通じて、プロセス全体の生産性が損なわれます。本研究で提示する形態数（morphology number）は、培養やプロトコルのモデル構築に役立ち、菌類形態全般への理解を深めることにつながります。