感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Lyco陰性鎖RNAウイルス。インフルエンザウイルスのゲノムは、ウイルスリボ核タンパク質複合体（vRNP）の形態でパッケージングされており、そこでは一本鎖ゲノムが核タンパク質によってカプセル化され、PA、PB1、PB2サブユニットからなるポリメラーゼ複合体と結合しています。感染した哺乳類細胞から完全な複合体を精製するため、HeLa細胞を組換えstrepタグ付きインフルエンザウイルスとともにインキュベートします。

ウイルスが細胞に進入すると、感染後に核内でウイルスRNAが合成されます。その後、界面活性剤を用いて細胞を溶解し、遠心分離および塩濃度に基づくクロマチン分画プロトコルを用いて、細胞質分画、核分画、およびクロマチン分画に分画します。最後に、各分画からstreptタグ付きのVRPをアフィニティー精製します。精製したVRPのタンパク質およびRNA組成を銀染色で分析した結果、本プロトコルを用いることで、クロマチンに強固に結合したVRPであっても、完全な状態で単離できることが示されました。したがって、インフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体をアフィニティー精製する標準的な手法と比較した本プロトコルの主な利点の一つは、インフルエンザウイルスmRNA合成の場であることが知られている感染細胞のクロマチンからVRPを精製できることです。

したがって、本手法はウイルス複製および転写の調節に関する疑問を解決するために利用可能です。例えば、ウイルスのmRNA合成やゲノムRNA合成に、どのようなウイルス因子や細胞因子、あるいはどのような翻訳後修飾が必要であるかといった点です。この手法を初めて用いる研究者は、核内分画法が生物化学的な条件に非常に敏感であり、また細胞株によって大きく異なる場合があるため、困難に直面する可能性があります。本プロトコルでは、感染多重度3でインフルエンザウイルスRWSN PB2-strep（PB2サブユニットのC末端にstrepタグが遺伝的に融合されている）を感染させた細胞を用いて開始します。

細胞を冷PBSで1回洗浄し、次に冷PBSを12 milliliters加え、ラバースクレイパーを用いてディッシュから回収します。細胞を50 milliliterのコニカルチューブに移し、遠心分離してペレット化します。

この手順で最も困難な点は、細胞分画プロトコルです。細胞核はホモジナイズや混合操作に非常に敏感であり、不適切に行われると、クロマチン抽出物が容易に損なわれる可能性があります。そのため、ホモジナイズの手法だけでなく、ここで示すライセートの一般的な取り扱い方法を遵守することが非常に重要です。

遠心分離による吸引後、PBSおよびResusを用いた処理に続き、細胞ペレットを10 millilitersの冷 sucrose bufferに懸濁させる。10 milliliterのプラスチック製血清ピペットに200 microliterのピペットチップを取り付け、細胞をそこに通して細胞凝集塊を分散させる。この懸濁液を氷上で10分間インキュベートする。

細胞を定期的に穏やかに転倒混和し、再懸濁させます。次に、non IET P 40を最終濃度0.5%になるように加え、高速で15秒間ボルテックスします。直ちに卓上遠心機を用い、4°Cで3,500 ×gにて10分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、15 mLコニカルチューブに移します。

上清を4 °Cで保存します。これは細胞質画分です。ペレットは、ここに示されているように、元の細胞ペレットよりも小さく、より白くなるはずです。

プロトコルを後で完了させる場合は、細胞ペレットを4 °Cで保存します。そうでない場合は、5 mLの冷sucrose緩衝液でペレットを洗浄し、前と同様に遠心分離して続行します。遠心分離が完了したら、上清を捨て、核を含むペレットを1.5 mLの冷核質抽出緩衝液に再懸濁します。

再懸濁したペレットを、密閉性の高いペスティルを備えた冷却済みの全ガラス製4 mL Dounceホモジナイザーに移し、20回ストロークして核をホモジナイズします。泡立ちに注意しながら操作を行うと、およそ10回ストロークしたあたりで抵抗が増加します。効率的にホモジナイズされたことを確認するため、位相差顕微鏡でサンプルを観察してください。

核はもはや球形ではなく、不規則な形態となり、破裂したように見えるはずです。核のホモジナイズが完了したら、1.5 milliliter のマイクロ遠心チューブに移します。このホモジネートを、回転ホイールを用いて 4 °C で 20 分間インキュベートします。

次に、マイクロ遠心機を用いて16,000 ×gで4 °C、10分間遠心分離します。遠心後、核質画分である上清を1.5 mLチューブに移し、4 °Cで保存します。その後、ペレットを37 °Cに予熱した消化バッファー1.5 mLで再懸濁します。

その後、分画物を37 °Cで10分間インキュベートします。次に、5 Mの塩化ナトリウムを42 µL加え、塩化ナトリウムの最終濃度を150 mMにした後、氷上で20分間インキュベートします。4 °Cに設定したマイクロ遠心機を用いて、16,000 ×gで10分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を除去し 4 °C で保存します。これが CH one 50 分画となります。ペレットを 1.5 mL の冷たい高塩濃度バッファーで再懸濁し、氷上で 20 分間インキュベートします。

マイクロ遠心機を用い、4 °Cで10分間、16,000 ×gで遠心分離します。遠心後、上清を回収し、4 °Cで保存します。これがCH 500分画となります。

分画プロトコルで保存した分画を取り出し、氷上に置きます。次に、細胞質分画に5 Mの塩化ナトリウムを300 µL加えます。その後、各分画からSpheroビーズに充填されたstrep T 100 µLを、15 mLコニカルチューブに移します。

ビーズに10倍量のstrep wash bufferを加えます。チューブを反転させて混ぜ、卓上遠心機を用いて1000 ×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。

バッファーによる洗浄を2回繰り返し、その後、ペレットを同量のstrep wash bufferで再懸濁させ、各フラクションに200 µLの洗浄済みstreps Act in bead slurryを加えます。チューブを4 °Cで1時間回転混和させます。次に、チューブを4 °Cで1000 ×gで1分間遠心分離し、上清を除去します。

次に、15 mLチューブで細胞質画分とともにインキュベートしたビーズに、洗浄バッファーを1 mL加えます。洗浄バッファーを加え、ビーズを1.5 mLチューブに移します。ビーズを1分間洗浄し、その後、4 °C、1000 ×gで1分間遠心分離します。

最後の洗浄ステップの後、この操作を2回繰り返します。フラットチップを用いて洗浄バッファーを完全に除去します。次に、溶出バッファーを100 µL加え、穏やかに混合した後、チューブを氷上に15分間置きます。

インキュベーション中、チューブの底を軽く叩いて、時々ビーズを混合します。15分後、4 °C、1000 ×gで1分間遠心分離します。溶出されたstrepタグ付きVRPを含む上清を回収します。

細胞をインフルエンザウイルス株WSNで9時間感染させ、分画したライセートを、ここに示すようにウェスタンブロッティングで解析しました。穏やかな核分離法を用いることで、大量の核タンパク質の放出を避けつつ、tubulinなどの細胞質タンパク質を効率的に抽出できます。低塩濃度で抽出されたクロマチン分画には、転写に重要なタンパク質が濃縮されていることに注意してください。

高塩濃度分画には主にヌクレオソームが含まれています。溶出した細胞質分画のタンパク質組成を決定するため、タグなしウイルス、RWSN、またはRWSN PB2-strepを9時間感染させたR細胞由来のvRNPsを、細胞質溶出液について示されているように銀染色で分析しました。ここでは、55 kDa以上の主要なバンドが95〜100 kDaの間のバンドと比較して顕著であり、NPとPA、PB1、PB2の高い比率が認められます。これは、ほとんどのstrep PB2が完全に形成されたvRNPの一部として精製されたこと、言い換えれば、可溶性ポリメラーゼはほとんど回収されなかったことを示唆しており、相対的な収量を比較しました。RWSN PB2-strepまたはRWSNで9時間感染させた後に精製されたvRNPsを、この銀染色ゲルに示されているように銀染色しました。感染9時間後には、4つの細胞分画すべてからvRNPsを精製することが可能です。

v RMPの最高濃度は核質に認められますが、細胞質やクロマチンからも相当量が精製可能です。このビデオを視聴することで、感染細胞の核から無傷のインフルエンザウイルスリボヌクレオプロテイン複合体を高収量で精製する方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、RNAおよびタンパク質の分解、ならびにタンパク質複合体の解離を防ぐため、クリーンなバッファーを使用し、サンプルを不必要に室温にさらさないことが重要です。

また、感染性のあるインフルエンザウイルスを扱うことは危険を伴うため、注意してください。溶解液にNP 40を添加するまでのすべての工程は、バイオセーフティーレベル2のワークベンチ下で実施する必要があります。