ヒト膵臓の収集プロトコル

本手順の全体的な目的は、解剖学的な方向性を維持した状態でヒト膵臓を解剖することです。まず、膵臓から十二指腸と脾臓を取り除き、次に膵臓から過剰な脂肪と血管を取り除いて清浄にします。第2段階として、前表面に青色インクを、後表面に黒色インクを塗布します。

次に、膵臓を3つの領域に分割します。それぞれの領域を均等な厚さのスラブ状に横断切片し、パラフィンカセットまたはOCT埋込用モールドに配置するか、さらに細切してバイアルに入れます。最終的に、将来の解析のために正確な解剖学的方向を維持したまま、膵臓の3つの領域すべてからサンプルを回収します。

この手法は、ベータ細胞の量または機能の喪失の根底にあるメカニズムや、免疫細胞による攻撃の性質など、1型糖尿病研究における重要な疑問の解決に役立ちます。膵臓の生体内での向きを維持するには細心の注意が必要であるため、膵臓の処理方法を視覚的に提示することが不可欠です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の組織技術者のLinda Snyderと、生物科学者のEmily Montgomeryが行います。

まず、手順に必要なすべての材料を準備します。最初に、パラフィンブロックを保持するカセットに、ドナー識別子、サンプルタイプ、アリコート番号、およびその他の追加情報を記載してラベルを貼ります。次に、同様にOCTモールドにラベルを貼ります。

各OCTコンパウンドブロックを包むのに十分な大きさのアルミホイルを切り、後で使用できるように脇に置いておきます。新鮮なサンプルおよび凍結サンプルを保存するために必要なバイアルをすべて準備します。必要に応じて、RNAlaterおよびRPMI培地を添加します。

次に、作業エリアを準備し、解剖ボード、滅菌済みの器具、および手順に必要なその他のすべての備品を、バイオセーフティフード内とカウンタートップの両方に配置します。すべてのカセットとOCT型を、使用順に近くに並べておきます。発泡スチロール製のボックスの底にあるドライアイスが浸るまで十分な量のイソペンタンを加え、凍結バスを作成します。

解剖を開始するために、十二指腸と脾臓を取り除きます。まず片端から十二指腸と膵臓を分離し始め、完全に切り離されるまで続けます。脾臓は緩く付着しているため、脂肪と膵臓から容易に取り除くことができます。

次に、鈍的および鋭的解剖を組み合わせて、膵臓から余分な脂肪、血管、神経を取り除きます。脂肪とリンパ節は、後で処理するために別途保管しておきます。洗浄後、膵臓をペーパータオルを敷いた解剖板の上に置きます。

膵臓の正しい向きを維持することは、本手順において最も困難な点です。確実に成功させるため、前表面と後表面を異なる色のインクで塗り分けます。綿棒を青色インクに浸し、膵臓の前表面にインクを広げ、余分なインクを吸い取ってください。

次に、新しいアプリケーターを黒色インクに浸し、膵臓の背面（後表面）に塗布します。膵臓を元の向きに戻します。前面（前表面）を上に向けた状態で、膵臓を3つの切片に切断する準備が整いました。

まず、頭部と体部の境界部分を切断します。次に、残りの部分をほぼ等分に分割して体部と尾部を分離し、膵臓の各部位の重量を記録します。まず頭部セクションから行います。

パンの切り分けと同様に、横断方向に切断し、各領域を約0.5 centimeterのセクションに分割します。膵臓の各領域のスライスが完了したら、頭部領域の最後のセクションである頭部・体部接合部セクションを取り出し、別の解剖板に置きます。このセクションを細かく刻み、RNA用およびRNA非用としてラベルを貼ったクライオバイアルに均等に分注します。

その後、バイアルを凍結させます。標準的な手順に従ってください。この手順を体尾部接合部セクションに対しても繰り返します。

細切したサンプルを回収後、すべての横断切片を右側に傾けます。各領域の切片を交互に除去します。パラフィンブロックおよびOCTブロックの場合、パラフィン包埋用の最初の切片を除去してください。

組織片が大きすぎる場合は、半分に切断します。カセットにAおよびBとラベルを貼ります。それでもまだ大きすぎる場合は、各切片を前の切断線に対して垂直に切断し、カセットにAからDまで時計回りにラベルを貼ります。ここで示すように、ラベルが左側にくるようにカセットを配置します。

次に、組織をカセットに入れ、蓋を閉じます。カセットを中性緩衝ホルマリンが入った容器に移します。OCTブロックの場合は、最も内側のセクションから始めて、各領域内でブロックに順次番号を付けます。

あらかじめラベルを貼った型に、OCTコンパウンドを薄く注ぎます。組織を導入する前に、組織をOCTコンパウンドで覆い、後で使用するためにサンプルを急速凍結させ、先に取り分けておいた組織に戻します。結節被膜周囲の脂肪および結合組織をトリミングして取り除き、膵リンパ節を単離します。リンパ節をDMEFを含む滅菌ディッシュに入れ、大きな結節は0.5 cm以下の大きさに細切します。

膵リンパ節を分離した後、組織を準備したバイアルとカセットに分け、後続の処理に回します。リンパ節の処理が完了したら、脾臓を細切し、同様の方法で保存します。十二指腸を処理するには、湿らせたガーゼパッドを使用して粘膜の粘液を拭き取り、粘膜を切り出した後、それを数セクションに切断します。

粘膜サンプルを前述のように分割します。この手順を用いることで、ここに示されているように、膵臓の各領域の代表的なサンプルを採取できます。頭部、体部、および尾部領域の重量はおよそ等しくなりました。

このビデオを視聴することで、ヒト膵臓をさまざまなサンプルタイプに処理する方法、特に方向性を維持する方法、および膵周囲脂肪からリンパ節を分離する方法について十分に理解できるはずです。