代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

本手順の全体的な目的は、細胞周期のキネティクスと進行を測定することです。まず、チミジンの代わりに細胞のDNAに取り込まれるromo、deoxy、ウリジン、またはBRDUを用いて、細胞をパルスチェイス標識します。その後、BRDUに対する抗体で細胞を免疫染色し、染色直後にフローサイトメトリーで解析します。

標識された細胞が細胞周期を経てG2期へと進むため、S期の細胞のみが標識されます。これらの細胞は、有糸分裂後に4NのDNA量を持つとして検出されます。その後、DNA量は2Nへと減少します。したがって、フローサイトメトリーによって得られた蛍光プロファイルを解析することで、細胞周期進行のキネティクスを決定することができます。

細胞同期化に化学物質を用いる他のプロトコルと比較して、本手法の最大の利点は、細胞分裂機構に不測の影響を及ぼす可能性のある生理学的摂動がないことです。私たちは、化学的同期化を用いて細胞周期の進行速度を研究しようとした際に、解析の妨げとなる予期せぬ結果が得られたため、まずこの方法を導入しました。本手法は、細胞生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

例えば、細胞種によって増殖速度が異なる根拠は何でしょうか。これを明らかにするため、本プロトコルではまずBRDUを用いて細胞をパルスチェイス標識します。まず、各タイムポイントにつき1枚、および以下の各コントロールにつき1枚の10 centimeterプレートを用意し、標識を開始してください。

BRDUのみ、PIのみ、BRDU陰性、PI陰性。各プレートに 5 × 10⁵ 個の MCF 7 細胞を添加し、補完済み DMEM で播種します。細胞を回復させ、接着させるため、プレートを 24 ～ 48 時間インキュベートします。細胞が 60% コンフルエントに達したら、培地を 10 µM を含む新鮮な DMEM に交換します。

BRDUを添加し、細胞を37°C、5%CO2条件下で1時間インキュベートして、DNAへのBRDUの取り込みを行います。この際、1枚のプレートは未処理のままにしておき、1時間後の陰性対照または0時間時点として使用してください。パルス標識培地を除去し、PBSで細胞を軽く洗浄して、2時間から8時間の各タイムポイントへと進みます。

新鮮な成長培地を加え、インキュベーターに戻します。その後、次節に記載する方法に従い、0時間および1時間のタイムポイントのプレートを直ちに回収します。細胞を回収するには、培地を吸引し、プレートを洗浄します。

まずPBSで洗浄し、次にトリプシンを用いて細胞をプレートから剥離させ、DMEMで回収します。390 ×gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。その後、1〜5 mLの氷冷PBSで細胞を洗浄し、390 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を廃棄し、100 µLの氷冷液で細胞を再懸濁します。

1% FBSを含む冷PBS。FBSは細胞の凝集を防ぐ役割を果たします。この手順において最も重要な点の一つは、回収した細胞から単一細胞懸濁液を確実に調製することです。

事実に基づいた操作を行います。これを達成するには、細胞をエタノールに一滴ずつ直接添加してください。これは極めて重要です。次に、細胞を固定するため、ピペットを用いて細胞を5 mLの氷冷した溶液に一滴ずつ添加してください。

15 mLコニカルチューブに70%エタノールを加えます。細胞を氷上で30分間インキュベートするか、4°Cで一晩保存します。この工程は、異なるタイムポイントでのサンプル回収を一時停止させるのに最適です。サンプルをエタノール中で数日間保持できるため、その後のプロトコルの残りの手順を同時に進めて、BrdUおよびプロピジウムヨード染色を行うことが可能になります。

細胞を4°Cから取り出し、90×gで5分間、3回遠心分離します。遠心後、固定液の大部分を吸引し、約50µLを残します。その後、ボルテックスで撹拌します。

ボルテックスしながらペレットを緩め、DNAを変性させます。2N HCl Triton X 100を1 mL、ゆっくりと滴下し、サンプルを室温で30分間インキュベートします。サンプルを390×gで5分間遠心分離して細胞をペレット化し、その後、上清を吸引して廃棄します。

次に、細胞ペレットを1 mLの0.1 M四ホウ酸ナトリウム溶液に再懸濁します。遠心分離後、細胞を回収し、上清を吸引して除きます。その後、細胞ペレットを75 µLのBRDU染色液に再懸濁します。

室温で45分間インキュベートし、その後は遮光して保存します。前述と同様に遠心分離で細胞をペレット化し、5 µg/mLのプロピジウムイオダイドを含む1 mLのPBSで細胞ペレットを再懸濁します。PI陽性サンプルをフローサイトメーターで解析する際は、前方散乱光（forward scatter）対側方散乱光（side scatter）のプロットを作成し、細胞のサイズ分布が適切であることを確認してください。

これらのパラメータは両方とも線形スケールでプロットしてください。同時に、FL three H 対 FL two W のプロットを表示し、PI染色と蛍光パルス幅を確認します。このプロットを用いてゲートを作成し、細胞周期の正常な分布パターン内にあると考えられる細胞分画を単離します。

一般的に、この分布パターンは、PI染色の2Nおよび4NのDNA含量を示す2つの細胞クラスターによって特徴づけられ、これらはそれぞれ細胞周期のG1期およびG2期を表しています。これら2つのクラスターの間に位置する一連の細胞は、細胞周期のS期に起こるDNA複製中の細胞を示しています。Y軸にログスケールでFL1-HまたはFITCを、X軸にリニアスケールでPIを表示し、ゲート処理された細胞をプロットしてください。

このプロットは、さまざまなコントロールを用いて残りのパラメータを設定し、データを収集するために使用します。解析にあたっては、PI単染サンプルのフローサイトメーターのローディングポートにセットし、x軸上のG1が約200の位置に来るようにゲインを調整してください。これは、PI染色のヒストグラムプロットで視覚化するとより容易になります。

次に、BRDUのみのサンプルをローディングポートにセットし、解析を実行します。BRDU陽性細胞とBRDU陰性細胞の2つの集団がプロット上に表示されるようにゲインを調整してください。理想的には、BRDU陰性細胞が10¹の直上または直下に位置するようにします。

最後のコントロールは、BrdU/PI陰性サンプルです。この陰性コントロールを測定し、細胞が右上および右下の象限のいずれにも現れないことを確認します。各プロットのパラメーターを設定すれば、フローサイトメーターのキャリブレーションが完了し、BrdUおよびPIで染色された細胞の処理準備が整ったことになります。各サンプルについて、PIゲート内の細胞から最低10,000個のデータを収集します。

次に、FlowJoやFACSDivaなどのソフトウェアを使用して、PI対FL2プロットからPI陽性としてゲートした細胞を用い、FITC対PIのプロットを作成します。これにより、細胞周期にある集団を区別します。続いて、BRDU陽性集団を単離するために、2つ目のゲートを作成します。

次に、細胞周期の進行の時間経過を追跡するために、G1またはG2含量を持つBRDU陽性細胞数を時間の関数としてプロットし、2つの大腸がん細胞株HT 29とLS 180の間で細胞周期進行のキネティクスを比較します。細胞は、BRDUパルス除去後、8時間にわたって1時間ごとに回収されました。

2つのプロファイルのキネティクスを比較すると、HT 29細胞株の対応するタイムポイントではこのピークが見られないのに対し、LS 180細胞ではBRDU投与からt = 4時間の時点でG1期のピークが出現していることが明らかです。これは、細胞周期のG2期における細胞周期進行の加速を示しています。乳がん細胞株のサイクリングプロファイルを生成するための大腸がん細胞株LS 180において。

MC7細胞を、BRDUパルスの除去後、8時間にわたって1時間ごとに回収しました。その後、免疫標識およびDNA対比染色を施した細胞を、その蛍光信号に基づいて分取しました。

ここでわかるように、CF seven細胞は、テストした2つの大腸がん細胞株のいずれよりも大幅に遅い速度でサイクルしました。このビデオを視聴することで、タイムポイントでの回収を伴うDNAの代謝標識によって、細胞周期キネティクスをどのように追跡できるかについて、十分に理解できたはずです。