癌バイオマーカーの局在の小型動物のCTガイド下時間領域拡散蛍光トモグラフィー

本実験の全体的な目的は、正位的に移植された神経膠腫（グリオーマ）マウスモデルにおける上皮成長因子受容体の発現を蛍光画像で捉えることです。これは、A IICマウスの左大脳半球に緑色蛍光タンパク質を発現するヒトU2 51グリオーマ細胞を接種することで達成されます。腫瘍を2週間成長させた後、2種類の蛍光トレーサーのカクテルをマウスに注入します。

次に、正確な画像再構成に必要な解剖学的データを収集するため、小動物用X線システムを用いてマウスを撮影します。このデータは、光トモグラフィーシステムの光源および検出器の位置を解剖学的に決定するために使用され、専用のソフトウェアを用いて蛍光データを収集し、最終的な画像を構築します。最終的に、この手法では蛍光イメージングとX線イメージングの両方を用いて、上皮成長因子の過剰発現に基づく腫瘍の画像を構築することができ、その精度は造影磁気共鳴画像法（MRI）と比較して評価することが可能です。

電荷結合素子（CCD）ベースの小動物蛍光断層撮影法などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、光電子増倍管を用いた単一光子計数検出により、光検出において格段に高い感度とダイナミックレンジが得られることです。この手法は、最終的に標的の発現を測定することで、分子療法の成功をモニタリングし評価するために利用できます。皮下腫瘍は表面イメージングを用いた非断層撮影法で容易に撮像できますが、本システムは最大数センチメートルの厚さの組織を透過して撮像するように設計されており、特に脳腫瘍への造影剤の送達および漏出の撮像に適しています。

この手法はがんのバイオマーカー発現に関する知見を得るのに有効ですが、感染症や肥満などの疾患研究、あるいはアルツハイマー病などの加齢に伴う要因の研究にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな人は、生物学的組織における光伝搬の拡散性と、拡散光の再構成にX線トモグラフィーを用いることの困難さから、習得に苦労します。そのため、この手法を視覚的に提示することが極めて重要です。

データ収集と画像再構成のステップは習得が困難な場合があるため、蛍光システムから収集されたデータが適切に校正されていることを確認することが重要です。near fastソフトウェアパッケージは、光学データを読み込み、X線断層撮影画像を用いて有限要素メッシュを作成するように設計されており、これが蛍光再構成の空間テンプレートとして使用されます。まず、麻酔をかけた無胸腺ヌードマウスを滅菌済みの手術用ドレープの上に置き、処置を進める前に麻酔深度を確認し、切開部位の皮膚を洗浄および消毒します。

ベタジンを用いて、切開部位に滅菌済みの手術用ドレープを被せます。メスを使用して、正中線よりわずかに左側、かつ眼内線より0.5 centimeters後方に小さな切開を加えます。指標を確認できるよう、結合組織を除去して頭蓋骨の表面を清浄にします。頭蓋骨が露出したら、滅菌済みの1 millimeterビットを装着した高速ドリルを使用し、中心線から2 millimeters左、かつbgmaから2 millimeters後方に穴を開けます。

鈍端の27ゲージ針を装着したHamiltonマイクロシリンジに、移植する細胞を充填します。次に、マウスを脳定位固定装置に設置します。その後、足指へのピンチテストで深い外科的および審美的な麻酔面にあることを確認し、動物に外科用ドレープを掛け直します。

次に、充填したシリンジを脳定位固定装置に固定します。頭蓋骨の穴の上にシリンジを配置し、針先を頭蓋骨表面から3 mm下に挿入します。続いて、針を1 mm引き抜き、ポケットを作成します。

次のステップでは、5分間かけて細胞を左大脳半球にゆっくりと注入します。注入が完了したら、針を引き抜き、穴をベタディンで拭きます。細胞が注入部位の外で増殖するのを防ぐため、マウスを脳定位固定装置から取り外し、露出した穴をあらかじめ温めておいたボーンワックスで埋めます。

最後に、滅菌済みの5-0ナイロン縫合糸で切開部位を閉鎖します。マウスを保温ケージに戻し、回復するまで観察します。回復後、マウスに0.1 mg/kgのブプレノルフィン130 µLを腹腔内注射（IP）し、イメージングを行うまで14日間腫瘍を成長させます。マウスのイメージング当日には、システムを起動し、レーザーと光検出器を約20分間ウォーミングアップさせます。

ドリフトとシステムの感度変動を避けるため、100度×4度のエンジニアードラインディフューザーをイメージングガントリーの正中心に配置し、励起レーザーをシステムの検出チャネル全体に均等な強度で分散させます。5つの集光チャネルすべてで検出される信号量を最大にするよう、ディフューザーの角度を手動で調整します。次に、光学密度フィルターを配置します。

すべての蛍光検出用光電子増倍管（PMT）および光密度検出用のPMTの前面に、2枚のニュートラル密度フィルターを配置します。透過率検出用のPMTの前面には、1枚のニュートラル密度フィルターを配置します。各レーザーについて順次、積分時間1秒で100回の時間的パルス広がり関数（T psf）を収集し、各TPSFをレーザーリファレンスで正規化した後、レーザーリファレンスの時間的ドリフトを補正し、検出器ごとおよびレーザーごとにすべての反復回数で平均化します。

これらの平均TPSは、撮像手順の12時間前に光学画像再構成に使用される検出器固有の装置応答関数です。蛍光トレーサーのカクテルをテストマウスに注入します。蛍光トモグラフィーシステムの正確なキャリブレーションと動物の体動制限が、本手順において最も困難な点です。

画像再構成は非常に不良設定な問題であるため、データ収集時のわずかな誤差が再構成画像に重大なエラーをもたらす可能性があります。正確なデータを収集するために、マウスを可能な限り固定し、スキャン前後にキャリブレーションを繰り返すことで、適切なタイミングで正確なキャリブレーションを得られる確率を高めます。準備が整ったら、麻酔をかけた動物をイメージングベッドのファイバーグラス製サポートの上に配置します。

持続ガス麻酔のためにノーズコーンに頭部を配置した後、バイトバーで歯を固定し、動物をテープで固定します。マウスはイメージングガントリーのおよそ中央に配置してください。このポジショニングは、励起レーザーをマウスの周囲に180度回転させ、あらゆる角度から見てレーザーの焦点がマウスの中央付近を照射していることを確認することで調整できます。

適切に配置した後、イメージングベッドとマウスを慎重にマイクロCTスキャナーへ移し、マウスの頭部全体について93 µm等方性の解像度で解剖学的情報を収集します。CT画像スタックを確認し、蛍光断層撮影システムで撮影するスライスを選択します。その後、イメージングベッドとマウスを慎重に蛍光断層撮影システムに戻します。

各イメージングスライスにおける光源位置の数、各TPSF測定の積分時間、各光源位置における反復回数、および以前に作成したCT画像スタックから目的のイメージングスライスの位置と数を設定します。次に、蛍光検出PMTの前にはすべての励起光を遮断するフィルターを、透過検出PMTの前には光学密度を調整するためのニュートラル密度フィルターを配置します。これらの検出器の飽和を避けるため、データ収集ソフトウェアを実行し、両方の励起波長において、定義された各光源・検出器位置で蛍光および透過のt psfを収集します。

収集したT psfの各セットについて、リファレンスPMTチャンネルを用いてレーザー強度をモニターし、記録します。マウスの外表面およびイメージングベッドの位置を決定します。CT画像から支持ロッドを特定し、マウスおよびイメージングロッドの範囲をカバーするマスクを作成します。

別途、near fastソフトウェアを用いて、マウスマスクから動物の有限要素メッシュを作成します。マイクロCTおよび蛍光空間レジストレーション座標に基づき、蛍光トモグラフィーシステムの光源および検出器の位置をメッシュ表面上に特定します。イメージングベッドの位置に干渉する光源または検出器の位置に関連する光学データポイントを除去します。

サポートロッドは、各光源検出器位置で収集されたデータをレーザーリファレンスによって正規化し、レーザーリファレンスの経時的なドリフトを補正し、購入時の実験的試験で決定されたフィルター感度を補正します。各光源検出器位置のデータのボーン比（born ratio）を算出し、均一な光学特性を持つ有限要素動物メッシュに基づく透過率のフォワードモデルシミュレーション値を乗じます。これは、光源または検出器の組織結合に関連する誤差を軽減し、データをモデルにキャリブレーションし、モデルデータとのその他の不一致を調整するために行われます。両波長で収集されたボーン比データのスケーリングされた差分で構成されるデータベクトルを作成します。

スケーリング係数はEGFR結合のコントラストを最大化するように選択し、各検出チャネルのTPSFを入力として、校正済みの差分データを用いて時間領域画像再構成を行い、コントラスト増強された標的トレーサーの蛍光マップを作成します。以下は、U2 51正位 glioma腫瘍を持つマウスにおいて、コアジストレーションされたCT解剖学的画像に蛍光再構成画像を重ね合わせた例です。蛍光再構成によって決定されたgliomaの重心は、コントラスト増強磁気共鳴画像法によって決定された腫瘍の重心から1 mm以内にありました。

データ収集用ソフトウェアはこのデバイス専用に構築されていますが、画像処理手法のほとんどはnear fasts software（available@nearfasts.org）を用いて行うことができます。したがって、本手順を試みる際は、画像再構成の前にシステムとデータの両方が正確にキャリブレーションされていることを確認することが重要です。このキャリブレーションでは、バイオマーカー標的トレーサーの画像再構成に続き、検出器間の感度差および時間差を考慮する必要があります。

非標的化トレーサーを用いて同様のイメージングを行うことで、受容体を介さない取り込みを補正することが可能になります。これにより、開発後、トレーサーの結合量および生体内における受容体密度の定量化が可能となります。この手法は、他の研究者がX線イメージングガイド付き蛍光断層撮影システムの設計を行うきっかけとなり、大型動物の全身イメージングへの道を開きました。

このビデオを視聴することで、がんバイオマーカーイメージングのためにX線解剖学的イメージングと光学イメージングシステムを組み合わせた、拡散蛍光トモグラフィー実験の実施方法について深く理解することができます。