ヒト膵島の染色プロトコル

この手順の全体的な目的は、ヘマトキシリン・エオシン染色および免疫組織化学を用いてヒト膵島を特性評価することです。これは、パラフィンブロックに埋め込まれた膵臓サンプルから連続切片を作成することによって達成されます。その後、切片を元の向きのままスライドグラス上に配置します。

一部のスライドはヘマトキシリン・エオジンで染色され、残りのスライドは免疫組織化学染色されます。最終ステップとして、染色されたスライドをスキャンし、症例ごとに整理します。最終的に、これらの画像はオンラインの病理データベースにアップロードされ、同分野の他の研究者が閲覧することが可能です。既存の手法に対する本手法の主な利点は、元の方向性を維持したまま、スライドを連続して染色できる点にあります。

手順の実演は、私の研究室の組織技術者のLinda Snyder、生物学者のEmily Montgomery、および臨床検査技師のTiffany Hippoが行います。まず、パラフィン切片作成の標準手順に従って、恒温槽とミクロトームを準備します。次に、正電荷スライドに症例番号、膵臓の部位、およびスライド番号を記入します。

すべての準備が整ったら、パラフィンブロックのカセットラベルを左側にしてマイクロトームのチャックに固定します。通常のミクロトミーの手順に従い、組織が均一に現れるまでブロックを薄切します。組織が均一に露出したら、厚さ約4 µmの連続切片のリボンを作成します。

必要な初期染色の数に応じて、3枚から6枚の切片を用意します。次に、リボン状の切片を個々に切り離します。各切片を順番に採取し、スライドグラス上に配置します。

鉛筆で切片番号を記録してください。切片が使用不可能な場合は、その番号を飛ばし、正確な順序で次の切片の番号付けを続けてください。スライドの向きはカセット内の向きを維持し、スライドラベルが左側に来るように注意してください。

次に、スライドをスライドラックにセットし、一晩乾燥させます。室温で、パラフィンブロックの表面を薄いパラフィン層で再封印して組織を保存し、室温または-20 °Cでアーカイブします。次のサンプルについても、この手順を繰り返します。

上記のように、H&E染色のための各レベルにおける連続切片の番号を維持することが重要です。各ブロックからの最初のスライドをスライドラックに入れ、そのラックをオートステイナーの最初のトレイに配置します。標準のHEプログラムを選択し、染色プロセスを開始します。

染色の終了後、オートステイナーからスライドを取り出し、カバーガラス封入のためにフード内に置きます。標準的な手法を用いて、各スライドにカバーガラスを載せます。最後に、印刷したラベルでスライドに標識を付け、フード内で十分に乾燥させます。

オートステイナーをセットアップし、必要な試薬をすべて準備することから始めてください。二重染色の場合はDacoプログラムを選択します。スライド枚数と、それぞれに適用する処理内容を入力してください。

製造元の推奨に従って、すべての試薬をオートステイナーにセットします。次に、TBST、クエン酸緩衝液、抗体、および本手順に必要なその他の試薬を準備します。スライドをキシレンに5分間浸し、脱パラフィン処理を行います。

スライドが乾燥すると、脱パラフィン中に過剰な背景染まりや孔の染まりが生じるため、乾燥させないようにしてください。使用前に、シトレート緩衝液をスティーマーに入れて予熱します。次に、脱パラフィン後のスライドを一連のエタノール洗浄に供します。

スライドを脱イオン水で最後にもう一度すすぎます。あらかじめ加熱しておいたクエン酸緩衝液にスライドを入れ、30分間蒸気滅菌（ステミング）させます。この後、スライドを直ちに室温の水槽に移し、完全に冷却されるまで放置します。

冷却後、適切な順序を維持するように注意しながら、スライドをDayco自動染色機のラックに移します。最後に、あらかじめロードしておいた二重染色プログラムを実行します。二重染色プログラムが完了したら、自動染色機からスライドを取り出し、脱水させる前に少なくとも1時間乾燥させます。

脱水処理を継続するため、スライドを80% ethanolに1分間浸します。続いて、95% ethanol、次いで100% ethanolに浸して脱水処理を続けます。最後に、スライドをxyleneに1分間浸して保持します。

手順を完了するため、サイトシールを用いてカバーグラスで直ちにスライドを封入します。臓器、ブロック番号、染色の種類、日付などの症例情報を含むラベルを印刷してください。染色のスライドをスキャンするため、各スライドにラベルを貼付します。

それらをスキャナーのトレイに置き、標準的な手順に従います。染色済みのスライドは室温で、未染色の残りのスライドは今後の使用に備えて-20°Cで保存します。最後に、染色画像をドナーおよび確認された組織型ごとに整理します。

低倍率および高倍率におけるKI 67とインスリンの二重染色の例を以下に示します。染色された膵臓切片の画像はオンライン病理データベースに送信され、仮想バイオバンクが構築されます。このデータベースを利用することで、研究者や1型糖尿病の研究に必要な情報に迅速にアクセスすることが可能です。

このビデオを視聴することで、ヒト膵臓から高品質なスライドを調製し、染色する方法について十分に理解することができます。