小脳パターン形成を理解する

私はキャシー・ミランです。シカゴ大学の人類遺伝学部および神経学部の助教授を務めております。私は脳の発達、具体的には小脳（頭蓋骨の後方に位置する脳の一部）の発達について研究しています。

これは運動発達における役割で最もよく知られていますが、実際には多くの事象に関与していることが分かっています。そして、脳の非常に興味深い部位です。パターン形成とは、生物学的システムにおけるパターンの発達のことです。これは発生生物学者が、ほぼあらゆる意味を込めて、ある種曖昧に使用する言葉の一つです。

そして、それが実際に何を意味するのかは、あまり明確ではありません。発生生物学者に尋ねれば、おそらく一人ひとり異なる定義を答えると思います。私が考える意味とは、脳、特に小脳が、どのようにして上下を認識し、また左右をどのように定義するのかということなのです。

構造のどの部分がどの部位になるかは、どのように決定されるのでしょうか。そして、胚発生の極めて初期におけるこれらの重要な根本的決定がなされた後、どのようにしてすべての細胞構造が集まり、小脳と呼ばれる精巧なパターンを持つ脳の部位を形成するのでしょうか。私たちは、小脳の発達、および発達中の小脳におけるパターン情報に非常に強い関心を寄せています。

小脳は非常に精巧なパターンを持つ組織であるためです。細胞層や細胞の種類があまり多くありません。そのため、脳の他の部位と比較すると、特に、まあ、相対的に単純な構造をしています。

また、小脳は非常に特異的な機能を持っており、多くの機能の一つに運動協調があります。マウスやヒトにおいて小脳に異常がある場合、その結果として現れる表現型の一つに運動失調があります。そのため、100年ほどのマウス遺伝学の歴史の中で、ある程度の特性解析が行われた自発的変異マウスが数多く発見されてきましたが、同時に、運動異常を持つマウスとしてJackson Labsの棚に単に保管されているだけの個体も多く存在しています。

また、これらのマウスの多く、おそらく60以上の自然発生株において、小脳の発達異常が認められます。このリソースは、小脳のパターン形成を駆動する発達メカニズムを調べる上で、非常に価値のある豊かなリソースです。そこで私の研究室が注力していることの一つは、ヒトゲノム計画およびマウスゲノム計画から得られたあらゆるツールを活用し、これらの分子試薬を用いて、これらすべての自然発生変異体で変異している遺伝子を特定することです。

このような変異体を見つけ出すことで、表現型中心のアプローチで遺伝子の探索を行います。つまり、遺伝子をランダムに選択してノックアウトするのではなく、まず表現型を特定し、そこから遺伝子を特定します。このアプローチを用いることで、目的の系に特に関連性の高い遺伝子を特異的に見つけ出すことができるためです。

当研究室をはじめとする多くの研究室で、これらの自然発生的なマウス変異体の多くをクローニングしてきました。表現型主導のアプローチを採用しているため、これらの自然発生的なマウス変異体は、非常に興味深い新しい生物学的知見をもたらしています。

どのような遺伝子が発見されるかについて、私たちはあらかじめ想定を置いていません。特にdal hoアナログやチャネル変異を探しているわけではありません。表現型に基づいて決定される遺伝子を特定しようとしています。

そのため、私たちは多くの新しい生物学的な知見を得ています。例えば、私の研究室で取り組んできた遺伝子や表現型の一つとして、私がポスドクだった頃に同僚のJim Linigと共に研究したdreと呼ばれるマウス変異体があります。dreとは、ドイツ語でコマ、あるいはコマのように回転することを意味します。これらのマウス変異体は、1929年にドイツで初めて出現し、その後Jackson Labsに蓄積されてきました。

この特定の遺伝子座には複数の対立遺伝子が存在し、小脳が不適切に形成されていたことが分かっていました。したがって、あらゆる種類の小脳細胞は存在していましたが、小脳のパターンは異常でした。中央部分が欠損しており、この中央部分は虫部（vermis）と呼ばれています。

そして、これらのマウスにおいて、成体期の表現型につながる初期胚の表現型が存在することを発見しました。この表現型は、LMX1A（limb homeodomain-containing box 1）と呼ばれる遺伝子の変異によるものでした。LMX1A遺伝子は、中枢神経系における背側（dorsal）の定義において最も重要な遺伝子のひとつであり、発生生物学において非常に興味深く重要な遺伝子です。

この稀な変異がなかったため、実際にはこの遺伝子がどのような機能を果たしているのかは誰にも分かっていませんでした。実際、この遺伝子は膵臓のインスリン産生細胞において別の理由で発見されており、糖尿病における潜在的な役割について研究していた人々が他にいました。

しかし実際には、LMX1Aによる老化自体は、膵臓の発達やアイレット細胞の発達において役割を果たしていないことが分かりました。実際、発達におけるその主な役割は、中枢神経系における背側パターニングを促進することです。私たちが最初にDR遺伝子（LMX1A遺伝子）をクローニングした際、この遺伝子が中枢神経系の背側部分のみで発現していることに気付きました。

実際、それは中枢神経系の背側部分や、小脳の周囲に位置する屋根板と呼ばれる領域だけに発現しているわけではありません。実際には、マウス胚の軸方向の全長にわたって中枢神経系の背側部分に発現しています。そして、これまで我々が検討してきたすべての脊椎動物において、軸方向の全長にわたって発現していることが分かっています。

また、この遺伝子が背側全体で発現しているため、中枢神経系の他の部位の背側においても何らかの役割を果たしていると考えました。そこで、脊髄におけるDRマウスの表現型の解析に多くの時間を費やしました。というのも、脊髄は小脳に比べて3次元的な構造がはるかに単純であり、中枢神経系の発達を理解するためのモデルシステムとして実際により適しているからです。

次にニワトリに移行したことで、実際、脊髄におけるLMX1Aの役割を解明するために、非常に多くの試薬を活用することができました。そして脊髄から再び小脳へと研究対象を戻しました。率直に言って、ニワトリへの導入技術がなければ、LMX1A遺伝子がどのような働きをするのかについて、これほどの深い理解を得ることはできなかったと思います。私の研究室のポストドクターであるVictor Chikoが、これらの実験を実質的に主導し、推し進めてくれた人物です。

そして彼は、ニワトリ電穿孔法（エレクトロポレーション）を用いて、LMX1a遺伝子の機能と中枢神経系における主要な役割を実際に解明した人物でした。正直なところ、ニワトリ電穿孔法がなければ、これほどの進展を遂げることはできなかったと思います。ニワトリ電穿孔法は、発達中のニワトリの神経系において遺伝子を迅速に過剰発現させ、2〜3日間の培養後に結果を得て、解析可能な表現型を確認できるため、非常に価値のある技術です。

実際にマウスを用いて、トランスジェニック動物などの遺伝子操作を行おうとすれば数ヶ月を要し、ノックアウトなどの場合は少なくとも1年半はかかることになります。そのため、ニワトリのシステムは、遺伝子発現を操作し、表現型を迅速に特定できる非常に有用なシステムです。例えば、発達中のニワトリの神経系、特に発達中の脊髄においてLMX1Aを過剰発現させると、中枢神経系または脊髄の背側全体が、中枢神経系の背側構造である屋根板へと転換されました。

以上の結果をVictorが行った他の多くの実験と合わせて検討したところ、LMX1A単独で屋根板（roof plate）の分化プログラム全体を駆動することが明らかになりました。屋根板は発達中の神経系における極めて重要なシグナルセンターであるため、これは重要な知見です。屋根板が存在しなければ、隣接する神経管細胞に背側感覚ニューロンへの分化を促すモルフォゲンを分泌することができなくなります。

そして、それらのシグナルがないと、それらの細胞は中間細胞型というデフォルトの状態になります。すると、脊髄だけでなく、実際には発達中の小脳においても、背側ニューロンの大部分が消失します。ニワトリの神経管以外のシステムを用いていれば、このような結論に容易に到達することはできなかったと思います。

私たちは小脳の発達に非常に強い関心を持っています。それは、マウスやニワトリなどのシステムにおける基礎生物学的な理由だけでなく、人間においても小脳奇形が存在するためです。そして、それらヒトの小脳奇形については、まだ十分に解明されていません。そこで、ヒトの脳奇形における世界的な権威の一人である同僚のWilliam Dobbins博士と共同で、ヒト小脳奇形原因遺伝子を特定するためのプロジェクトを開始しました。

私たちはいくつかの手法を採用しています。最大の取り組みの一つは、DNAデータベースと臨床データベースを構築したことです。そこでは、明確なヒト小脳奇形を持つ500人以上の患者をリクルートし、MRI画像を収集するとともに、それらをDNAサンプルと相関させました。これにより、遺伝子探索のリソースとして活用できるようにしています。というのも、ヒトの小脳奇形は全く十分に分類されていないからです。正直に申し上げれば、私たちの研究を通じて受け取る10件のスキャンにつき、少なくとも1件は、これまで記述されたことがなく、実質的に認識されていなかった何らかの奇形であると言えます。

ヒトの小脳奇形の中で最も一般的であり、臨床医に最もよく知られているのがDandy-Walker奇形です。しかし、実際にはこれはヒトの小脳疾患における一種の包括的（便宜的）な診断名に過ぎないことが分かっています。多くの医師が、小脳に異常が見られる場合にそれをDandy-Walkerとして分類してしまうためです。

このように、私たちはダンディ・ウォーカー奇形の研究に患者さんを募り、多種多様で興味深い小脳奇形が見出されています。そこで、私たちはこのリソースを新しい小脳発生遺伝子の探索に活用しています。というのも、発生生物学者としての私の考えでは、人間とは一つの巨大な突然変異実験のようなものであり、新しい発生遺伝子を発見するための絶好の情報源であると考えているからです。

そこで、これらの遺伝子を特定するために、いくつかの手法を用いています。その一つは、マウスにおいて小脳の発達に関与することが分かっている遺伝子に着目し、それらの遺伝子のヒトにおける配列を解析することです。そして実際に、ごく最近、ヒトにおける最初のLMX1A変異を特定しました。

これまで、私たちの基礎科学研究を臨床研究へ応用する機会は非常に限られていました。しかし、その状況は急速に変化しています。新しい遺伝子が次々と見つかるにつれ、罹患したお子さんのご家族に対し、新たな遺伝カウンセリング情報を提供することが可能になっています。

率直に言って、そこが私たちの研究が最も大きな影響を与える部分だと考えています。したがって、5年後のこの分野に対する私の展望としては、マウスモデルの特性解析とヒトの小脳奇形に関する研究の両方によって、より多くの遺伝子発見がなされていることだと思います。小脳の発達に関与する遺伝子群について、私たちはより深い知見を得ることになるでしょう。

そして、今後の目標は、それらの遺伝子が互いにどのように相互作用し、実際の生物学的プロセスをどのように駆動しているのかを明らかにすることです。小脳を形成するために起こる様々な細胞イベントを、これらの遺伝子がどのように制御しているのでしょうか。小脳には主要な神経細胞種がわずか5〜7種類しか存在しないため、率直に言って、中枢神経系全体の理想的なモデルになると考えています。

これらはすべて、さまざまな典型的様式で配置されています。これらの前駆細胞の分化決定と初期分化を駆動する分子について、解明が進んでいます。また、これらの細胞がどのように増殖するのかについても、理解が深まっています。

したがって、5年以上はかかると考えていますが、最終的には、神経管の発達から小脳の発達までを完全に追跡し、成熟した形態の小脳を実現できると考えています。小脳は比較的単純なシステムであるため、小脳全体の形成を駆動する分子や発達上の出来事を実際に解明できるという希望があります。これは、人間の遺伝的診断の分野や小脳発達の分野にとって重要であるだけでなく、それらのメカニズムを脳の他の部位に適用できると考えています。

小脳は比較的単純な構造をしていますが、発生過程における多くの出来事は小脳に特有のものではありません。小脳から得られた知見を、大脳皮質のような中枢神経系のより複雑な領域に適用させ、そこで学んだ教訓や経路が脳の他の部位にどのように当てはまるかを解明することができます。