CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

これはMax MIDIマグネットです。「注意：極めて強力な磁場」と記載されています。こんにちは、カリフォルニア大学アーバイン校生理学・生物物理学部のMike Collins研究室のMelanie Matthewです。

本日は、Miltenyi Biotec社のキットを用いたCD4陽性T細胞のネガティブセレクション調製法について解説します。ここではMiniMACSとMACS Magnetを用意しています。MiniMACSは大規模な分離に使用され、MiniMACSに適合するカラムを用いて最大10⁹個までの細胞を処理することが可能です。一方、MACS Magnetはより少量の細胞サンプルに使用されます。

したがって、陽性分離を行うか陰性分離を行うかに応じて、適切な抗体で細胞を標識します。これらの抗体には磁性ビーズが付着しており、磁石に吸着します。陰性選択の場合、目的の細胞はカラムを通過するため、目的の細胞を含む溶出液を回収することができます。

今夜ご紹介する手法は無菌的な操作ではないことを付け加えておきます。したがって、これらの細胞を細胞培養に使用する場合は、無菌的な器具を用いて、すべて組織培養用フード内で行ってください。今回はCD4陽性T細胞の調製手順をお見せしますが、これらの手法の多くは、Miltenyi Biotec社のキットを用いた他の細胞種の精製にも適用可能です。

マウスからリンパ節を摘出しました。この詳細な手順については、JoVEの第7回「2光子イメージングのためのリンパ節調製」で解説しています。次に、70 µmのセルストレーナーを用いて、リンパ節を単一細胞懸濁液にまですり潰します。それでは、6 mLシリンジの背面を使用して、リンパ節を単一細胞懸濁液にすり潰していきます。

リンパ節はフィルター内のRPMIに入っており、適切な単一細胞懸濁液を作成することが重要です。フィルターを使用する理由は、細胞の凝集がないことを確認するためです。すり潰しが終わったら、フィルターを培地から取り出し、ストレーナーを通過した単一細胞懸濁液を使用します。

すり潰しを行う際は、組織を可能な限り十分に分散させるようにしてください。この単一細胞懸濁液から、CD4陽性T細胞を精製します。さて、組織のすり潰しが完了し、リンパ節の大部分が消失したことが確認できます。

ここには、6つのリンパ節すべてから集まった、少量の脂肪組織と、結合組織を伴うリンパ節の被膜のような断片が凝集して残っています。ここでセルストレーナーを取り除きます。すると、培地が非常に濁っているのがわかります。

フィルターから最大限の細胞を回収し、一部がフィルターに付着することを考慮して、単一細胞懸濁液を十分に満たします。これを数mLの培地で洗浄し、すべての培地を15 mL Falconチューブにピペッティングして、その後の精製のために細胞をペレット化するように遠心分離します。こちらが、300 Gで10分間遠心分離してペレット化した単一細胞懸濁液です。

単細胞懸濁液中に死細胞が多く含まれると考えられる場合は、Miltenyi社の死細胞除去キットを使用することをお勧めします。ペレット化したので、培地を捨てて赤血球溶血を行い、その後、細胞数をカウントし、これらの特定の細胞に対してCD4陽性T細胞のネガティブセレクションキットを使用します。それでは、赤血球溶血を行います。

リンパ球とともにペレット化した赤血球を溶血させます。まず水を加えて溶液の浸透圧を下げ、その後10X-DPBSを加えて再び1X溶液に戻すことで溶血を行います。リンパ球は赤血球よりも浸透圧の変化に耐性がありますが、迅速に作業しないとリンパ球まで溶血させてしまうため、注意が必要です。迅速に作業するために、実際にシステムに水を加える前に、溶血に必要な分量をあらかじめ準備しておきます。

リンパ球の溶解を防ぎ、赤血球のみを溶解させるため、水を加えた数秒後に10 X-D-B-P-Sを添加します。具体的には、900 µLの水（ほぼ1 mL）に、100 µLの10 X-D-B-P-Sを加えます。

両方のパイプの準備が整いました。溶解（lysis）の際、まず水を加え、数秒待ってからチューブを軽く振り、次に10 X-D-B-P-Sを加えてさらに軽く振ります。溶解させる赤血球が多くある場合、壊れた細胞膜が集まって、大きな不定形の塊のようなものが形成されるのがわかります。

ここに少量ありますが、細胞膜が少し壊れているのがわかります。したがって、溶解処理を行った後、ピぺッティングにミスがあった場合に備えて、浸透圧を適切に調整し、それ以上の溶解が進まないようにするために、培地を数mL細胞に加えます。これで、リンパ球の単一細胞懸濁液が準備できました。

改めて、赤血球溶血処理を行い、遠心分離してペレット化します。その前に、ヘモサイトメーターで細胞数を計測し、CD4陽性T細胞陰性選択キットに使用する抗体量を決定します。それでは、MAXバッファー中で細胞を遠心分離します。赤血球溶血処理後、ペレットがより白くなっていることがわかります。

次に、CD4陽性T細胞のネガティブセレクションを行います。まず、細胞を遠心分離した際の培地およびMAXバッファーをすべて捨てます。そして、CD4陽性T細胞のネガティブセレクションのステップ1である、ビオチン抗体カクテルによるラベル化を行います。

その後、冷蔵庫で10分間インキュベートします。さて、細胞の初回インキュベーションが完了しました。次に、抗生物質を結合させたマイクロビーズを添加し、再び冷蔵庫で15分間インキュベートします。

今回の細胞分離では、Miltenyi Biotec社のLSカラムを使用します。まず、カラムをマグネットホルダーにセットし、3 mLのMACSバッファーを流してカラムを調製します。カラムを開き、突起部分がマグネットの内側を向くように配置してください。次に、カラムにMACSバッファーを加えます。バッファーがLSカラムを通り、下端から滴下し始めるのが確認できるはずです。カラム内が完全に空になっても問題ありません。

液体の表面張力により、細胞を添加するまで液が枯渇することはありません。細胞を添加する前に、max bufferをカラム全体に完全に浸透させることが重要です。さて、anti-biotin磁気ビーズ、細胞、およびmax bufferを用いて15分間のインキュベーションを行った後、バッファーを捨て、細胞数に適した量のバッファーで再懸濁させます。

そのため、milli tinyプロトコルを確認する必要があります。その後、Maxバッファーで洗浄したばかりのカラムにそれらを適用します。それでは、細胞懸濁液をカラムに添加します。

これはネガティブセレクションカラムであるため、通り抜けた細胞を回収します。この場合、それらはすべてCD4陽性T細胞であるはずです。次に、12 mLのMAXバッファーでカラムを洗浄し、再び溶出液を回収します。ここにはCD4陽性T細胞のみが含まれているはずです。そして、回収したCD4陽性T細胞を遠心分離で沈殿させ、再懸濁した後、タウイメージングに使用する適切な染料で標識します。

また、精製した細胞から少量のサンプルを採取し、anti CD3およびanti CD4で標識してFACS解析を行い、CD4陽性T細胞の純粋な集団が得られているかを確認します。こちらが、先ほど遠心分離した細胞です。これは純粋なCD3陽性、CD4陽性T細胞の集団であるはずです。

以上で、CD4陽性T細胞のネガティブセレクションについて説明しました。Miltenyi Biotec社のキットを用いてこれらの細胞をマウスに養生的移植し、自らのT-cell receptor（TCR）およびマシン実験に使用します。皆様の実験の成功を願っております。