隔離された両心室ワーキングウサギ心臓のNADH蛍光イメージング

この手順の全体的な目的は、代謝を研究することです。動作心臓標本におけるNADHイメージングを用いることで、まずウサギの心臓を摘出し、次に心臓の4つの腔すべてに正常にカニューレを挿入して動作心臓モデルを構築することで、これを達成します。

最終ステップは、イメージング装置をセットアップし、異なるペースメーカー速度でNADHデータを収集することです。最終的に、蛍光NADHのイメージングを通じて、心臓の代謝変化を示すことができます。ラノア逆灌流などの既存の方法と比較したこの手法の主な利点は、心臓が正常な方向の流れを持ち、心臓自身が冠灌流のための圧力を提供するという、生理的状態で動作している点にあります。

本手法は、電気生理学および致死性不整脈のメカニズムにおける重要な疑問を解決するのに役立ちます。これは、冠血流代謝と電気活動の関連性を研究するための生理学的モデルを提供することで実現されます。血管および心腔のカニュレーションの手順は習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。

不適切な手技は心臓を損傷させ、実験全体を台無しにする可能性があります。実験を開始する前に、作動心臓システムのチャンバー内にあるすべてのチューブを精製水で洗浄し、ポンプを回してシステム内から水を排出してください。LOR灌流ポンプ、左心灌流ポンプ、および右心灌流ポンプのラインにセルロース膜フィルターを装着します。

PERFUSE eightをシステムに追加した後、各圧力センサーの2点校正を行います。ウォータージャケットチューブと熱交換器を加熱する恒温水槽の電源を入れます。PERFUSE eightの加熱に使用する水槽の電源を入れます。

PERFUSE eightを閉回路で循環させるポンプを起動し、循環タンクを起動してPerfuse Eightに酸素を供給します。マイクロファイバーオキシゲネーターまたはヘモフィルターが、80 kilopascalsで95%の酸素をperfuse eightに供給していることを確認してください。最後に、熱交換器によって循環するperfuseの温度が維持されていることを確認します。

37°Cにて、まず心臓作動システムを定圧・LRFモードに設定し、心臓摘出を開始します。ウサギを鎮静させた後、大動脈ブロックの圧力を50から60の間に設定します。

ペントバルビタールとヘパリンを、耳縁静脈または後肢内側の外側伏在静脈に注射します。ウサギの疼痛反射が消失したことを確認後、速やかに胸腔を開きます。心膜を切開し、大動脈をクランプして、心臓と肺を摘出します。

肺静脈の単離を容易にするため、肺は付着したままにします。次に、シリンジにPBS 60 mLとヘパリン200 unitsを充填します。5 mmのカニュラを取り付け、大動脈にカニュレーションを行います。

サイズ0のシルク縫合糸を用いて、大動脈をカニューレに固定します。次に、シリンジをゆっくりと押し、心臓から血液を洗い流します。まず心臓を大動脈ブロックに接続し、拍動心灌流系をセットアップします。

コネクターに斜めの角度から近づけ、コネクターが接続された状態でPerfuse eightをカニューレにゆっくりと滴下させます。これにより、大動脈への空気の混入を防ぎ、恒圧ランデルフ（Lendorf）モードで心臓を灌流させる際の冠動脈塞栓症を防止します。

脂肪と結合組織を除去し、以下の血管を確認します。下大静脈、上大静脈、大動脈、肺動脈、および肺静脈です。次に、上大静脈を結紮します。

肺動脈が左右の肺動脈に分岐する直下で切断します。残っている血管は肺静脈です。これらを心臓と肺の間でまとめ、1本の縫合糸ですべて結紮します。

これには2つの重要な理由があります。第一に、肺に接続されている血管を縛ることで、カニュレーション完了後に漏出が発生しないようにするためです。そして第二に、後のカニュレーションに向けて、両側のVNA大静脈を単離しておくことが重要であるためです。

次に、肺を取り除きます。左心耳の隅に適当な大きさの穴を開け、そこにperfuse eightを十分に満たします。続いて、カニューレにperfuse eightを完全に満たした状態で、心耳に挿入します。

次に、組織を保持しながら、カニューレを心耳に縫合します。左心耳の組織は非常に繊細で、容易に裂ける可能性があります。そのため、一度で左心房にカニューレを挿入することが重要であり、失敗すると挿入が不可能になる場合があります。

ポンプ2を起動し、左心房への血流を確保します。実験期間中、前負荷を2から6 torの間に設定してください。圧力の調整が必要になる場合があります。

目標圧力から2 mm Hg以内に維持してください。次に、ポンプ1（ラングロールポンプ）を一時的にオフにして、心臓を作動心モードに切り替えます。大動脈圧を10 mmHgまで下げてから、ゆっくりと80〜100 mmHgの範囲まで上昇させます。

これにより、大動脈弁が開き、通常の生理的条件下と同様に機能することが可能になります。システムに直接接続したカニューレを用いて、最終的な後負荷圧を、左室（LV）最高圧の約20%低い値に設定してください。

下大静脈を介して右心房にカニューレを挿入し、カニューレを静脈に縫い付けます。気泡が混入しないように注意してください。ポンプ3番（右側ポンプ）を起動し、右心房に血流を供給します。

圧力を約3 torに設定します。最後に、空気が混入しないように注意しながら右心室にカニューレを挿入し、カニューレを肺動脈に縫い付けます。これで両心室へのカニュレーションが完了します。

次に、信号の取得を行います。圧力トランスデューサーカテーテルを大動脈カニューレ経由で大動脈内に慎重に挿入します。大動脈弁を通り、緩やかに lv まで進めてください。

カテーテルチップが適切に配置されると、LV圧信号が期待通りに現れます。次に、単相活動電位電極を心室心外膜にそっと押し当てます。電極信号にわずかなモーションアーチファクトが生じることは正常です。

次に、実験デザインで指定された位置に従って心臓をペースメイクするため、右心房にバイポーラ刺激電極を配置します。そして、心臓の関心領域にCCDカメラの焦点を合わせます。カメラにはエミッションフィルターが装着されている必要があります。

NADH蛍光を検出するため、ワークステーションの照明を消し、カメラが装着されているUV光源を用いて心外膜を均一に照射します。ソフトウェアの設定を行い、1秒あたり2フレームで画像をキャプチャするようにします。次に、ライブアップデートモードを選択し、関心領域内の平均ピクセル強度をモニタリングします。

灌流が十分であれば、蛍光で示されるNADHレベルは心外膜表面で低く安定しているはずです。実験が完了したら、プログラムを停止します。心臓を取り出してください。

PERFUSE 8およびシステムのチューブとチャンバーを精製水で洗浄します。概説したプロトコルに従い、粘膜TM溶液または希釈した過酸化水素溶液を用いて、定期的にシステムをすすいでください。心臓は、1分間に200から400拍のサイクル長でペースメーカー刺激を行いました。

拡張期のLVPは通常0から10 Torrの間であり、最小拡張期大動脈圧は約60 Torrであった。最高収縮期LVPは充填圧と収縮性に依存し、最適には60から80 Torrの間であるべきである。最大大動脈圧と最大LVPは密接に一致すべきである。ウサギの心臓に典型的な単相性活動電位は、速い脱分極相と特徴的な再分極相を持つ。作製した標本から活動電位を容易に記録できたが、通常、拡張期に小さなモーションアーチファクトが生じた。

赤色の枠で囲まれた関心領域における平均NADH蛍光値を測定し、ペーシングレートが洞調律に近いときの、サイクル長300、200、150ミリ秒の3つのペーシングサイクルにおけるミトコンドリアの還元状態の変化をモニタリングした。サイクル長が短縮しても、ベースラインのNADHレベルは比較的一定であった。300ミリ秒以下ではベースラインのNADHレベルが上昇し、150ミリ秒で最大の上昇が見られた。また、信号は収縮に伴って振動し、その振動周波数は心拍数と一致した。

これらの振動の振幅は、虚血または低酸素によって引き起こされるより長い時間スケールの傾向よりも常に小さいものでした。200 beats per minuteでの前表面全体の高解像度蛍光NADHイメージングでは、400 beats per minuteにおいて一定で空間的に均一でした。NADHレベルは心外膜全体で大幅に増加しました。

顕著な空間的不均一性が観察され、最大の増加はRVおよびLVの中隔領域で認められました。習得すれば、正しく実施することでこの手法を45分以内に完了させることができます。この手順を行う際は、大動脈または左心房に気泡が混入しないように注意することが重要です。本手順に続いて、

心臓に電位感受性色素を負荷させるなどの追加の手法を用いることで、局所虚血などの病理学的シナリオにおいて、心臓表面の電気的活動と代謝活動の関連性を明らかにするなど、さらなる疑問への回答を得ることが可能です。この技術の開発により、心臓生理学の研究者は、より生理学的に適切なモデルを用いて、病理的条件下における心臓の代謝および伝導障害を研究することが可能となりました。