遺伝子発現用機械の機能的アッセイのための小規模の核抽出物

本実験の全体的な目的は、細胞から抽出した機能的な核装置を用いて遺伝子発現を解析することです。まず、HeLa細胞を回収し、膨潤させます。次に、細胞を溶解させ、3番目のステップとして遠心分離を行うことで核をペレット化します。

可溶性で機能的な遺伝子発現機構を得るために、核を塩抽出、濃縮し、透析します。最終的に、核抽出液の機能性は、RNAポリメラーゼを転写およびスプライシング系に共役させて評価することで、その転写およびスプライシング活性に基づいて評価できます。バルクの核抽出液調製のような既存の手法に対するこの技術の主な利点は、少量の細胞で核抽出液を調製できることです。

まず、FBSと抗生物質を添加したDMEM培地を用いて、HeLa細胞を150 mmプレート3枚に播種します。37 °C、5% CO2のインキュベーターで、細胞密度が90%コンフルエントになるまで培養します。この時点で、HeLa細胞培養液から培地を吸引し、1枚あたり13 mLの室温PBSで1回洗浄した後、PBSを吸引します。各プレートを数秒間傾け、残ったPBSを吸引してください。

次に、セルリフターを用いて各プレートの底端まで細胞をかき集め、1.5 mLのエッペンドルフチューブに回収します。最後に、マイクロ遠心機を用いて 100 ×g、4 °C で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。その後、細胞ペレットからPBSを吸引し、チューブの目盛りを確認してヘマトクリット値（PCV）を推定します。

次に、PCVの2倍量の低張緩衝液を細胞ペレットに加えます。チューブを軽く振って再懸濁させます。必要に応じて、1000 µLピペットで細胞懸濁液をゆっくりとピペッティングし、細胞の凝集を解消します。

その後、先ほどと同じ遠心分離条件で細胞をペレット化します。遠心分離後、低張バッファー層を慎重に吸引します。細胞は膨潤し始めており、細胞容積は約750 to 1000 microlitersまで増加しています。

最終容量が1.5 millilitersになるように新しい低張緩衝液を加え、細胞を緩衝液中で再懸濁します。最後に、再懸濁した膨潤細胞を氷上で10分間インキュベートし、細胞を冷却します。ダウンホモジナイザーを低張緩衝液で洗浄し、細胞と一緒に氷上に置きます。

次に、キムワイプなどの繊細なタスクワイパーを使用して、乳棒を拭き取ります。1000 µLの延長マイクロピペットチップを使用して、ダウンからバッファーを除去します。その後、ピペットを用いて、冷却した膨潤細胞をダウンへ移します。

この手順で最も困難な部分は、細胞溶解の確認による成功の判定です。顕微鏡下で各ドロップを確認した後、気泡が入らないように注意しながら、タイトペステルの先端をゆっくりと5回上下に動かして細胞を溶解させます。次に、溶解させた細胞懸濁液を5 µL分取りてエッペンドルフチューブに移し、トリパンブルーを10 µL、1×PBSを15 µL加えます。

細胞溶液をスライドグラスに滴下し、光学顕微鏡で溶解状態を確認します。溶解した細胞の核は、3回洗浄後に青色に見えます。生存細胞が多く観察されるため、溶解は不十分です。5回洗浄後、十分に溶解しています。

最後に、溶出した細胞をあらかじめ冷却したエッペンドルフチューブに移し、マイクロ遠心分離機を用いて 1500 ×g、4 °C で5分間、細胞懸濁液を遠心分離します。次に、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を新しいチューブに回収します。ここで、チューブの目盛りを確認し、パッチ核体積（PNV）を推定します。

マイクロピペットチップに、PNVの半分量の低塩緩衝液を満たします。次に、エッペンドルフチューブの底にある核にマイクロピペットチップを挿入します。緩やかに混合しながら、緩衝液を核の中にゆっくりと注入します。

チューブを軽く弾いて、ペレットが完全に再懸濁していることを確認します。次に、PNVの1/2量の高塩濃度バッファーを加え、チューブを転倒させて素早く1回混合します。チューブを4 °Cで30分間回転させます。

最後に、マイクロ遠心機を用いて、核を18,000 ×g、4 °Cで15分間遠心分離します。まず、上清を500 µLとり、冷却したマイクロコンへと移します。高塩濃度核抽出物を14,000 ×g、4 °Cで15分間遠心分離した後、ミニラコンを反転させ、新しい個別のEORチューブに移します。

1000 ×g、4 °Cで2分間遠心分離した後、高塩濃度核抽出液は約115 µLまで濃縮されます。次に、この高塩濃度核抽出液を45 µLずつミニ透析SLIに分注します。スライドの底部がフローターの底部に接していることを確認してください。

次に、SLIを500 millilitersの冷却した透析バッファーに入れます。最後に、分注したサンプルを4 °Cで1〜2時間撹拌します。透析後、核抽出液は混濁して見えます。この図は、小規模な核抽出液とバルクの核抽出液における、共役RNAポリメラーゼII転写およびスプライシング反応を比較した代表的なデータを示しています。

A-C-M-V-D-N-A構築物をバルクまたは小スケールの抽出液中でインキュベートしたところ、$\alpha$-アマンチジンを添加して転写を停止させた5分後の時点で、新生pre-mRNAが同程度のレベルで合成されていました。また、スプライシング中間体およびスプライシング産物は、両方のタイプの抽出液において同様のキネティクスで経時的に蓄積しました。これらの代表的な結果は、共役RNAポリメラーゼII転写・スプライシングシステムの効率が、バルク核抽出液と小スケール核抽出液で同様であることを裏付けています。小スケール抽出液の有用性を実証するため、スプライシング阻害剤E 7 1 0 7またはネガティブコントロール化合物Platyanaly Fで処理したHeLa細胞から抽出液を調製し、本図に示すように共役RNAポリメラーゼII転写・スプライシングアッセイを実施しました。その結果、Platyanaly F処理細胞およびE 7 1 0 7処理細胞の両方から調製した抽出液において、RNAポリメラーゼIIによる転写が効率的に行われることが確認されました。

対照的に、analy F処理細胞から調製した抽出液ではスプライシングが正常に起こりましたが、E 7 1 0 7処理細胞では消失していました。これらのデータは、小規模な細胞の特殊処理に小規模核抽出液を利用することの概念実証となります。習得すれば、この手法は5時間以内に完了させることが可能です。