ガスクロマトグラフィーによるオペラントエタノール自己投与とエタノール判別中エタノールのマイクロダイアリシス

本手順の全体的な目的は、エタノールの自己投与セッション中における脳ダイアリゼート中のエタノール濃度をモニタリングすることです。この測定値を同期した自己投与行動と比較するため、まずマイクロダイアリシスガイド、カニューレ、およびテザーボルトを外科的に植え込み、次にラットにエタノールのオペラント自己投与を訓練させます。第2のステップでは、マイクロダイアリシス中にエタノールの自己投与が妨げられないよう、ラットをヘッドステージテザーに慣れさせます。

次に、エタノール自己投与セッション中にマイクロダイアリシスを行い、透析液の一部をエタノール分析用に準備します。続いて、水素炎イオン化検出器を備えたガスクロマトグラフを用いて、透析液サンプルのエタノール濃度を分析します。最終的に、得られた結果から、エタノール自己投与セッション中に目的の脳領域にエタノールが到達する時間経過が示されます。

この手法の、尾静脈や伏在静脈からの採血などの既存の方法に対する主な利点は、サンプル採取時の侵襲性が最小限に抑えられ、動物が行動課題を遂行している間に、目的の脳領域における薬物濃度を経時的に測定できることです。一般的に、この方法に慣れていない人は、多くの専門的なスキルを必要とするため苦労しますが、その多くは繰り返しの練習や経験を通じてのみ習得できます。なお、本手順のデモンストレーションを行うのは、当研究室の学部研究助手であるJeffrey Dilleyです。

示されているすべての動物実験 procedure は、テキサス大学の施設内動物ケアおよび使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認されており、実験動物の飼育および使用に関するすべてのガイドラインおよび規制に従っています。テキサス大学オースティン校は ALAC 認定施設であり、これらの行動マイクロダイアリシス実験では、関心のある脳領域の上に 21 gauge のカニューレを外科的に留置した long Evans ラットが適切に扱われています。すべての動物は、以下の手順を開始する前に、少なくとも 1 週間の術後ケアと回復期間を経て、健康な状態でなければなりません。

ラットを、Lichter社製の格納式レバーとティッパーチューブを備えたMed Associates社製のオペラントチャンバーに入れ、10% sucrose溶液を得るためにレバーを押すよう訓練させます。ラットがsucrose溶液に対して反応するよう訓練された後、適切な訓練スケジュールを開始します。このスケジュールでは、最後から2番目のオペラントセッションの前夜から、複数回の飲水セッションにわたって溶液にエタノールを徐々に添加していきます。動物を麻酔し、鎮静レベルを確認した後、ラットのヘッドステージにあるテザーボルトにテザースプリングを取り付け、カウンターバランスレバー、アーム、スイベルテザー、スプリング、およびリングスタンドで構成される装置に慣れさせます。

マイクロダイアリシス実験の前日に、ラットをホームケージに入れ、自由摂取の餌と水を与えてオペラント室で一晩過ごさせます。その後、テザーおよび付属機器を装着した状態で翌日のトレーニングセッションを完了させます。イソフルランでラットを麻酔した後、足指へのピンチテストで鎮静状態を確認し、人工脳脊髄液を還流させたマイクロダイアリシスプローブを挿入します。プローブを適切に固定し、プローブの流量を0.2 microliters per minuteに調整します。

ラットをオペラント室内のホームケージに入れ、すべての透析装置を装着した状態で一晩過ごさせ、餌と水を自由にとれるようにします。プローブ挿入の翌日、実験開始の少なくとも2時間前に、プローブを動作流量まで上げます。ハミルトンシリンジを用いて、プローブの流量が安定しており、設定流量の90%以上であることを確認してください。

透析サンプル中の神経伝達物質を評価する場合は、実験の全フェーズでサンプルを採取してください。まず、動物がホームケージにいる間に透析サンプルを回収し始めてください。回収したサンプルは、後の解析に適した方法で保存します。

ラットを慎重にオペラントチャンバーに移し、チャンバーを制御するオペラントプログラムを開始します。レバーがチャンバー内に伸びてくる前の2サンプル分、ラットが待機している間もサンプリングを継続します。各透析液サンプルの分画をエタノール分析用に採取するため、適切な量のアリコートを2 mLのガラスバイアルにピペットで移し、気密性セプタムでバイアルを封止します。エタノールサンプルのピペット操作と封止は迅速に行ってください。

エタノールは揮発性が高く、サンプル量も少ないため、サンプル調製に不整合があったり時間がかかったりすると、不正確な結果につながります。残量は神経伝達物質分析用に保存してください。20分間の飲水期間は、Med Associatesのコンピュータプログラムによってレバーがチャンバー内に押し出され、ラットがそれを押して飲水ボトルにアクセスできた時点から開始されます。

飲水期間中はずっとサンプリングを継続し、飲水期間が終了した後、コンピュータープログラムによってボトルをチャンバーから回収します。マイクロダイアリシス実験の最後に、さらに20分間の飲水後期間として動物をチャンバー内に保持します。ラットを麻酔した後、プローブを抜去します。

動物を直ちに人道的に安楽死させない場合は、プローブの経路を確実に可視化させるためにオブテレーターを再度挿入します。実験から3日以内に脳を採取してください。サンプルを、50 °Cに加熱したヘッドスペースオートサンプラー、ヘリウムを移動相としたキャピラリーカラムを備えた、水素炎イオン化検出器付きガスクロマトグラフを用い、外部エタノール標準品とともに分析します。

クロマトグラムの記録と分析には、クロマトグラフィー・ワークステーション・ソフトウェアを使用して、システムをエタノール分析に備えさせます。循環水槽を用いてオートサンプラープレートを加熱し、空気および水素タンクを開きます。次に、スタートアッププログラムを開始します。

準備が整ったら、20分間の燃焼を行い、ファイバーを汚染除去します。100 mLのメスフラスコを用いて、238 µLの95%エタノールを水で100 mLまで希釈し、標準液を作成します。1対1の段階希釈を用いて標準系列を作成してください。

標準物質をガラスバイアルにピペットで分注し、試料の調製時と全く同様に密閉します。標準物質と共に必ず水ブランクを測定してください。標準物質と試料をオートサンプラーのトレイにセットし、液体分注量全体が気化するまで加熱します。

標準物質およびサンプルを分析するため、どのサンプルがどのオートサンプラーのスロットにあるかを記載したサンプルリストを作成し、各サンプルを穿刺（プンクチャー）する必要があることを明記します。データファイルの保存先フォルダを指定した後、サンプルに適したメソッドを選択し、分析を開始します。システムによるサンプルの分析が完了した後、プログラムが各ピークを正しく積分しているかを確認してください。

各既知の外標準物質に対するピーク高さをプロットします。エタノール濃度。得られた点から線形関数を用いて、各透析液サンプルのエタノール濃度を補間します。

この図は、3つの濃度のエタノール標準物質および、エタノール自己投与セッションの終了時に採取されたラット透析液サンプルの例となるクロマトグラムを示しています。エタノールのピークは比較的対称であり、保持時間が一定で、S/N比が10より大きい必要があります。これらの基準を満たさない場合は、システムのメンテナンスが必要です。高品質なクロマトグラフィーと正しく調製された標準物質によって線形な標準曲線が得られ、これを用いて、自己投与期間中にエタノール自己投与動物から採取された透析液サンプルのエタノール濃度を算出します。

算出された透析液中のエタノール濃度は、in vivoでのプローブ回収率による補正が行われておらず、脳組織中のエタノール濃度のわずか一部に過ぎません。エタノールの定量的なマイクロダイアリシスが必要な場合は、細胞外液からプローブへと拡散するエタノールの抽出率を実験的に決定します。この手法に習熟すれば、適切に実施することで約4〜5時間で完了させることができます。

これは行動セッションの長さに応じて異なります。本実験のマイクロダイアリシス相を正常に完了できるかは、準備段階の質に大きく依存します。この手順を行う際は、ラットが十分にハンドリングされており、ダイアリシス実験中に起こり得る注意散漫を誘発する刺激に動物を慣れさせ、動物の自己投与行動に影響が出ないようにすることが重要です。