組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上

本手順の目的は、膨張した肺の構造を維持しながら、マウス肺のex vivoにおける微小転移の検出能を向上させることです。まず、組織におけるBGC（背景色）の主因となる血液を除去するため、in situでPBSを用いて肺を灌流します。次に、PFAを注入して肺を膨張させ、その後、肺組織を膨張した状態で固定するためにピンチオフ（遮断）を行います。

次に、肺を取り出してPFAでさらに固定するか、あるいは単一の肺葉を凍結切片作成用に包埋します。最終ステップとして、組織をXal溶液で染色し、LA zag腫瘍細胞を可視化します。最終的に、全肺葉または肺組織切片における転移を、双眼鏡顕微鏡または光学顕微鏡を用いて単一細胞レベルまで検出することが可能です。既存の手法と比較した本手法の主な利点は、血液由来のバックグラウンドが除去されるため、微小転移の検出能が大幅に向上することにあります。

ケタミン、キシラジン、およびアセプロマジンを約150 microlitersのPBSに溶解した溶液を腹腔内投与し、マウスを麻酔させることからプロトコールを開始します。マウスの痛覚反射が消失したことを確認後、手術台に固定します。背面の毛を寝かせ、70%ethanolで脱毛させます。

腹部から頸部まで皮膚を切開します。皮膚を左右に引っ張るか、取り除きます。頸静脈などの太い血管の破裂を防ぐため、胸部の腹膜を慎重に切開します。

これにより、灌流の効率が向上します。次に、21〜24ゲージの針を装着した20 mLシリンジを用いて、肝臓の下にある心大静脈を切断します。拍動している心臓の右心室に10〜15 mLのPBSをゆっくりと注入し、肺が完全に白くなり、心拍が停止するまで続けてください。

次に、血管クランプを用いて肝臓の上方の血管と横隔膜を挟みます。10 mLシリンジに3%パラホルムアルデヒドを充填し、21〜24Gの針を用いて右心室に約2 mL注入します。

胸郭外で気管を露出し、胸郭の外側から気管内にアルデヒド約3 mLを注入して肺を膨らませます。その後、直ちに針を抜き、穿刺部位の気管を血管鉗子で挟んで遮断し、固定されるまで10分間待ちます。次に、血管鉗子の上の血管を切断します。

次に、クランプを取り外し、右心室にPBSを約2 mL注入して過剰なパラホルムアルデヒドを除去します。針を用いてすべての肺葉の下部を穿刺し、気管の血管クランプを取り除きます。その後、前回の注入と同様に、希釈した包埋液3〜5 mLを気管内に注入します。

肺葉内のパラホルムが溶液に置き換わった時点で、注入を停止します。ピンセットで心臓を牽引し、結合組織の靭帯、血管、および気管を切断して、慎重に肺を取り出します。その際、心臓が肺に接続されたままの状態を維持してください。

1つの肺葉を凍結切片用に取り分けておき、残りの肺組織を全肺染色のに使用します。肺を密閉可能なプラスチックカップに入れ、2% formaldehydeとPBSで固定します。肺の上にガーゼを置き、溶液に浸った状態にして室温で30分間放置します。

30分後、固定液を取り除き、組織をPBSで3回十分に洗浄します。Xalストック溶液1mLを基本染色液で1:40に希釈して、使用直前にXal溶液を調製し、それを少なくとも10mLカップに加えます。ガーゼを用いて肺を浸します。空気交換ができるよう蓋を軽く閉め、遮光した状態で37°Cで3～5時間インキュベートします。

インキュベーション後、xal溶液を除去します。PBSで肺を1回洗浄して残留xal溶液を取り除き、4%パラホルムアルデヒド（PBS溶液）を少なくとも10 mL加えます。これで組織の準備が整い、組織学的検査に使用可能となり、4°Cの4% PFA内で長期間保存することができます。

まず、埋め込みモールドの3分の1まで未希釈のpoly forze埋め込み剤を満たします。次に、肺葉をモールドに入れ、肺葉が完全に覆われるまで埋め込み剤を追加し続けます。気泡が入らないように慎重に操作し、埋め込まれた肺葉を4 °Cで20分間インキュベートします。

次に、ドライアイスとイソペンタンの混合液でゆっくりと凍結させ、包埋した肺を切片作成用に準備します。必要に応じて、-80 °Cのフリーザーに移して保存することが可能です。クライオスタットを用いて、葉から7～10 µmの凍結切片を作成し、市販の凍結切片用スライドガラスに貼付します。貼付後、直ちに切片をXAL染色液に浸し、加湿チャンバー内で37 °Cで24時間インキュベートします。翌日、PBSでスライドガラスを2回、1回につき5分間洗浄します。

続いて、蒸留水で短時間すすぎます。次に、核快紅（nuclear fast red）で10秒間対比染色し、xalをより際立たせるための淡い対比染色を施した後、直ちに蒸留水で対比染色液を洗い流します。より濃い対比染色が必要な場合は、染色時間を30秒以上に延長してください。

イムノマウントを用いてスライドを封入します。done LM eightマウスOSモデルにおける転移の形成を再調査しました。laxyを形質導入した細胞と非形質導入のコントロールdoneおよびLM8細胞を同時に注入したマウス、およびコントロールdone細胞を注入したマウスの、灌流および非灌流肺の代表的な画像を、ここに記載の通り使用しました。

非灌流および灌流肺において、肉眼的および顕微鏡的な転移は検出されませんでした。しかし興味深いことに、dun LA Z細胞を注入したマウスでは、xgl染色により、非灌流肺の表面に単一細胞または少数の細胞クラスターからなる青色の微小転移 foci が認められました。肺のin situ灌流および固定により、dun la z微小転移の検出能はさらに向上しましたが、対照のLM eight細胞を注入したマウスでは肉眼的fociへの増殖は見られませんでした。直径0.1 millimeter以上の、半透明でかろうじて検出可能な肉眼的転移 foci が非灌流肺で認められました。肺の灌流を行っても、これらのfociの検出能は向上しませんでした。

しかしながら、ate LAC Z細胞を注入したマウスでは、非灌流臓器の表面にX gal染色の青色を呈する複数のマクロ転移が検出されました。また、非灌流臓器の表面にはマイクロ転移も検出されました。さらに、肺を灌流することで、マクロ転移およびマイクロ転移の検出能がさらに向上しました。

その結果、灌流した組織の透明度が高まったことで、臓器表面の下にある病巣も可視化され、微小転移および巨視的転移がより高い密度で、より多く認められるようになりました。肺組織の凍結切片を用いた追加の組織学的解析により、LAX Z導入細胞およびLM8細胞を注入したマウス、ならびにDun LAX Z細胞由来の原発腫瘍を持つマウスにおいて、肺転移の検出能が向上したことが確認されました。肺切片において、微小転移あるいは単一細胞レベルの病巣が認識されました。

これは、それぞれの対照細胞の原発腫瘍を持つマウスでは観察されませんでした。さらに、マクロ転移は、対照のLM eight細胞を注入した動物よりも、LM eight LA C細胞を注入したマウスにおいてより明確に確認されました。このビデオを視聴することで、ZE2における肺灌流および固定の手順と、それに続く摘出肺における転移の摘出後染色の方法について、十分に理解できるはずです。

この手法は、あらゆる種類のがん研究において肺への転移分布を評価するための極めて感度の高いエンドポイント読み出し法であり、また、転移病変の早期検出に用いられるmicro CT、PET、MRIなどの現在のin vivoイメージング技術の改善に向けたベンチマークとしても活用できます。