Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

本手順の総合的な目的は、金ナノ粒子を用いた細胞運動性アッセイを用いて、細胞の運動性を経時的に定量測定できるようにすることです。これは、まず金ナノ粒子をコーティングするためのガラスカバースリップを準備することによって達成されます。具体的には、エンドトキシンフリーのカバースリップにゼラチンをコーティングし、その後、加熱乾燥させます。

第2段階では、塩化金酸を還元して金ナノ粒子を生成し、ゼラチンコーティングされたカバーガラスをこの溶液で均一にコーティングします。次に、実験で設定した時間枠に従って、細胞を金ナノ粒子コーティング済みのカバーガラス上に配置します。続いて、ゼラチンが金ナノ粒子を置換し、トラックを形成させます。

最終ステップは、移動する細胞によって形成されたトラックを顕微鏡で撮影し、細胞運動性のモニタリングと定量化を行うことです。最終的に、フリーウェアを用いてトラックの面積測定が行われます。タイムラプスイメージングなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点の一つは、標準的な光学顕微鏡と標準的なカメラのみで実施でき、無料で利用可能なイメージングソフトウェアを使用する点にあります。

さらに、本アッセイはハイスループットスクリーニングが可能な手法であるため、多数のサンプルの分析および比較を容易に行うことができます。この手法は、さまざまな生理学的要因や細胞運動の影響に関する知見を提供できるだけでなく、病原体が感染細胞の運動性に及ぼす影響の研究など、他の系にも適用可能です。一般的に、本手法を初めて行う方は、プロトコルに記載された分量や温度を厳格に遵守する必要があるため、習得に苦労する可能性があります。

このプロトコルでは、成功を確認するために、沈殿した金ナノ粒子の最終溶液の色を評価することに重点を置いています。FGOキネティックトラック運動性アッセイの手順を習得することは困難であるため、本手法の視覚的な実演が不可欠です。

これらには、細胞・分子生物学研究室では一般的ではないいくつかの手順が含まれています。ゼラチンコーティングしたカバーガラスを調製するには、まずゼラチンと脱イオン水を再懸濁させて、最終濃度が0.5 grams/300 millilitersの溶液を作成し、その後、混合物を15から30分間オートクレーブします。この操作は、組織培養フード内でゼラチンを添加してから2時間以内に行うことが重要です。

まず、酸洗浄済みのカバーガラスを8〜9枚、100 mmのプラスチックディッシュに移してコーティングの準備をします。カバーガラス同士やディッシュの壁面に触れないように配置してください。各カバーガラスに、プレート上に溢れないよう注意しながら、ゼラチンを2〜3滴慎重にピペットで滴下します。

次に、ゼラチンコーティングしたカバーガラスを入れたディッシュをオーブンに入れ、90 °Cで10分間加熱します。10分後、ディッシュをオーブンから取り出し、組織培養フードに戻します。

余分なゼラチンをピペットで静かに取り除きます。ディッシュをオーブンに戻し、カバーグラスを 70 °C で 45 分間乾燥させます。カバーグラスが乾燥したら、ディッシュをオーブンから取り出し、組織培養フードに戻します。

滅菌済みの針を用いて、カバーガラスの端を慎重に持ち上げます。次に、滅菌済みのピンセットを使用して、ゼラチンコーティングされたカバーガラスをディッシュから取り出し、24ウェルプレートの個別のウェルに移します。次のステップは、コロイド金コーティングカバーガラスを調製することです。

組織培養用クリーンベンチ内で、滅菌済みエンドトキシンフリーのエルレンマイヤーフラスコを用い、14.5 mMの塩化金酸溶液1.5 mLとオートクレーブ滅菌済みの脱イオン水13.5 mLを混合し、0.5%クエン酸ナトリウム溶液10 mLを調製します。カバーガラス8〜9枚につき、淡黄色の溶液が得られるはずです。塩化金酸は毒性があるため、慎重に取り扱ってください。また、光に敏感であるため、沸騰ステップは低照度の環境で行ってください。

溶液が沸点に達したら、フラスコをホットプレートから取り外し、スターラープレートへ移します。溶液中にコロイド金粒子を形成させるため、クロロ金酸溶液15 mLに対して0.5%クエン酸ナトリウム溶液0.7 mLを撹拌しながら加え、そのまま約2分間撹拌を続けます。この間に、溶液の色は淡黄色から透明、灰色、紫色、そして濃紫色へと変化します。

最終的に赤ワイン色、あるいは好ましくは錆色になる前に、コロイド金溶液を10 milliliterピペットで吸い上げ、室温になるまで1〜2分間ピペット内で冷却させます。次に、24ウェルプレート内のゼラチンコート済みカバーガラスの上に、0.5〜1 milliliterを添加します。コロイド金が塗布されたカバーガラスが入った24ウェルプレートを37 °Cのインキュベーターに入れ、30分間インキュベートします。粒子がゼラチンコート済みカバーガラス上に沈降した後、光学顕微鏡下でその密度を確認します。

金ナノ粒子の適切な分散は、ソーラートラックの端を簡単かつ効率的に識別するのに役立ちます。最適な密度は細胞サイズによって異なります。金粒子の濃度が高すぎると細胞の移動能が妨げられ、逆に金粒子の濃度が低すぎると、運動性の正確な軌跡を記述する能力が制限されます。

このため、個々の実験では、同じバッチで製造された、あるいは密度が同じであることが確認されているカバーガラスのみを併用する必要があります。金粒子の濃度が不十分な場合は、ゼラチンコーティングしたカバーガラスにコロイド金溶液をさらに0.5〜1 mL加えてください。しかし、ここで示している例のように金粒子の濃度が高すぎる場合は、コロイド金溶液を再度調製し、新しいカバーガラスにコーティングし直すことが唯一の効果的な方法です。

粒子密度が適切であれば、プレートを37°Cのインキュベーターに戻し、1時間から一晩インキュベートします。その後、カバーガラスを滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に3回浸し、結合していない金粒子を洗い流します。次に、コロイド金でコーティングしたカバーガラスを、PBSを満たした清潔な12ウェルプレートのウェルに入れ、使用時まで4°Cで保存します。カバーガラスを乾燥させないようにし、作製日から2〜3ヶ月以内に使用してください。

次のステップは、細胞培養用のコロイド金コーティングカバーガラスを準備することです。まず、約0.3 millilitersの培地をあらかじめ添加した24ウェルプレートの各ウェルに、カバーガラスを配置します。その後、各コロイド金コーティングカバーガラスに約5,000から50,000個の細胞を播種します。細胞数は細胞種によって異なりますが、同一領域内で複数の細胞による走行軌跡が重なり合わないよう、細胞密度を十分に低く抑える必要があります。

プレートに蓋をし、37 °C、5% carbon dioxide のインキュベーターで6〜24時間培養します。細胞種の運動能に基づき、最適な時間は細胞種ごとに実験的に決定する必要があります。培養後、すぐに解析しないカバーガラスは、まずPBSに2回浸し、続いて室温で3% para formaldehyde に15分間浸して固定します。顕微鏡を用いて、固定前または固定後のカバーガラス上の単一の移動細胞によって形成された軌跡の画像をキャプチャします。細胞軌跡の撮影に使用する倍率は細胞種によって異なりますが、結果を比較できるように、各研究において同一の倍率を使用しなければなりません。

単球の場合、40倍の倍率が適しています。ImageJ、JNIH image、またはImage Toolなどのフリーソフトウェアを使用して、ここで示したキャプチャ画像から、各サンプルにつき10〜20個以上の細胞によって除去されたコロイド金の中央値を決定します。ここに示しているのは、40倍の対物レンズで撮影した、刺激を与えていない単一の単球によるコロイド金粒子の除去経路です。非運動性細胞は、自身の周囲に特徴的な小さな楕円形または円形の軌跡を作成し、これは基底レベルの低い運動性を示しています。対照的に、運動性の高い細胞は、不規則な形状に起因する方向性を持った運動として細長い軌跡を描き、全体的に広い除去面積を形成することを特徴とします。

細胞の軌跡は、Image Jソフトウェアのフリーハンドツールを使用してその領域を囲むことで最適に解析できます。その後、Image Jの解析メニューにある計測ツールを用いて、定量的な面積測定を行うことができます。この手順を行う際は、プロトコルに記載されている量と温度を厳密に守ることが重要です。これらの逸脱は最終的な結果に強く影響する可能性があります。このビデオを視聴することで、ゼラチンコートカバースリップの作製方法、金ナノ粒子および金ナノ粒子コートカバースリップの調製方法、そして光学顕微鏡を用いた細胞移動のモニタリングおよび定量評価の方法について十分に理解できるはずです。

ホットプレートで沸騰した溶液を扱う際は、特にフルオロ、AIC酸、クエン酸ナトリウムの沸騰溶液から発生する蒸気が危険であることに留意してください。本手順の実施にあたっては、ドラフトチャンバー内での作業や常識的な安全策を常に講じる必要があります。