幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた

本実験の全体的な目的は、構築されたヒト免疫系を持つマウスを作製することです。これはまず、マウスを手術に向けて準備し、次にトロッカーに胸腺の一部を装填することで達成されます。MatrigelをCD 34陰性およびCD 34陽性の導入細胞と混合し、その混合物をトロッカーに注入します。

次に、マトリゼルの構築物を腎被膜下に移植します。最終的に、遺伝子組み換えCD8 T細胞による標的腫瘍の拒絶反応を、生体PETイメージングおよび腫瘍の物理的測定によってモニタリングできます。完全なニューロンモデルのような既存の手法と比較した本手法の主な利点は、ヒト胸腺内での遺伝子改変ヒト幹細胞の分化を研究でき、その後、分化した系統のin vivoでの有効性試験が可能になる点です。なお、本手順の演示を行うのは、当研究室の技術者であるGregory Bristol、Bernard Levin、およびSean Kimの3名です。

この概略図では、mart1特異的T細胞を保有するキメラマウスを作製するために、本研究で使用した改変BLTモデルの概要を示しています。胸腺インプラントは、自家胎児肝から単離した形質導入済みおよび未導入のCD34細胞から再構成されます。その後、形質導入された細胞の一部を凍結し、4〜6週間後に照射したマウスに注入します。

このビデオでは、麻酔により動物が不活発になった後、th生体構築物を植え込む手順を実演します。まず、各マウスの左側を、背中の中心から腹部にかけて、腰から肩まで除毛します。各個体の体重を記録した後、耳にパンチ穴を開けて個体番号を付け、各個体の肩にカルプロフェン0.3 millilitersを皮下注射します。

次に、マウスを左向きに右側を下にして寝かせます。16ゲージの先端が丸いファイルチップ付きがん移植用針のトロカーをPBSでフラッシュします。先細鉗子を使用して、胸腺の一片をPBSの入ったディッシュに加え、その後、ロッドを用いてトロカーを水平に保持します。

チップの先端のすぐ内側で組織を吸引します。腎被膜の下にトロカーを滑り込ませて組織を注入する工程は、この処置において最も困難な部分の一つです。次に、助手の協力を得てください。

エンドまたはオーフのポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、5 µLの冷却済みMatrigelを細胞が入ったチューブに加え、緩やかに撹拌して混合します。トロカーを水平に保ちながら、助手がMatrigelをピペッティングする間に、ロッドをゆっくりと後方に引きます。

各マウスのトロッカーに混合します。まず、動物の露出した皮膚をベタダインでスワブし、次にイソプロパノールワイプで拭き取ります。皮膚の下で最も色の濃い部分を2回確認し、脾臓の位置を特定します。

鈍端ピンセットで腎臓上の皮膚をつまみ上げ、脾臓から背側に約5 mmの位置にある腎臓を確認します。脾臓と平行に、皮膚を約15 mmの長さで切開します。その下の腹膜筋層においても、同様に切開を行います。

オスでは、腎臓が直接視認できるはずです。腹部を軽く押して、腎臓を押し出してください。メスでは、左手で腹部を圧迫して腎臓を露出させたままにし、まず止血鉗子で卵巣を把持し、次に腎臓を外に引き出して、臓器を体外に保持しやすくします。

腎被膜の後端に小さな穴を開け、そこにトロッカーを挿入して、トロッカーの開口部が完全に腎被膜で覆われるまで腎臓に沿ってスライドさせます。次に、右手の小指を使用して組織を注入します。最後に、閉じた止血鉗子を用いて、腎臓をゆっくりと元の位置に戻します。

腹膜をダブルボウ結びで1針縫い、巾着のように皮膚を絞った後、2箇所の創傷クリップで固定します。最後に、各眼にPBSを1滴滴下し、マウスをケージ内の床材の上に横向きに寝かせます。すべてのマウスに同様に移植した後、動物が腹臥位に戻ったことを確認してから離れます。

この最初の図は、ヒト化マウスにおけるTHI生体移植の代表的な画像を示しています。この図では、胸腺組織の正常な発達と、ヒトCD4陽性およびCD8陽性T細胞の生理的な組織分布が実証されています。再構築後、動物はCD4陽性およびCD8陽性T細胞が正常に分布したヒト免疫系を保持しています。

メラノーマ腫瘍を担有するマウスの代表的な画像を図に示します。灰色の領域はCTスキャン画像を示しています。色の付いた領域は、PETスキャンによって検出された腫瘍の代謝活性を示しています。

本実験において、CTスキャンのみでは白色の円で示された領域に大きな腫瘍塊があることが示されました。しかし、in vivo PETイメージングで示されているように、この領域の大部分は壊死組織と瘢痕組織で構成されており、腫瘍の退縮と消失を評価する上で、PETイメージングがより感度が高く正確な方法であることが強調されました。本手順の後、T細胞の機能に関する疑問を解決するために、T細胞のフェノタイピングやex vivo活性化などの他のアッセイを実施することが可能です。