蛍光活性化細胞選別（FACS）胎児マウスの内臓からの自律神経前駆細胞の分離用に最適化された手順

この手順の全体的な目的は、末梢神経系神経節から精製された神経前駆細胞集団を誘導することです。まず、胎児マウスから目的の器官または特定の神経節を解剖し、次いで組織を部分的に解離させることで、個々の細胞を周囲の培地中に遊離させます。

次に、細胞懸濁液をろ過し、残留している組織塊や大きな凝集物を除去します。最後に、細胞懸濁液をフローソートし、目的の細胞集団で発現している蛍光リポーターに基づいて、目的の集団を分離します。最終的に、発生の異なる段階で単離した前駆細胞間、または精製された異なる神経細胞型の集団間で、遺伝子発現パターンの比較を行うことができます。

抗体ラベルを用いた細胞集団の単離と比較して、本手法の主な利点は、適切な免疫試薬が利用できない場合が多いことです。特定の遺伝子を発現する細胞をラベルする代わりに、離散的なニューロンサブセットで蛍光タンパク質を産生する遺伝子組み換えマウスを用いることで、これらの細胞集団を単離することが可能になります。本稿では、腸管および口腔の神経発生経路からの神経前駆細胞の単離についてこの方法を実証しますが、蛍光リポーターを発現する他のモデルシステムにも適用可能です。

一般的に、この手法に不慣れな方は、ソース組織を消化しすぎて細胞生存率を低下させてしまう傾向があるため、苦労することがあります。解剖を開始する前に、明視野照明で胚を観察し、目的の構造にピントが合っていることを確認してください。その後、蛍光実体顕微鏡を用いて蛍光レポーターの発現をスクリーニングし、トランスジーン陽性胚を特定します。

安楽死させた後、組織を解剖している間に胚が浮かないように、解剖皿に少量のPBSを加えます。胚の体の側面と、肝臓の高さの腹部にかけて皮膚を切開します。胚を背中側に向け、微細ピンセットを用いて固定します。

前肢の高さで、横隔膜の位置に別のピンセットを挿入し、素早く内臓を尾側へ、かつ背側の体壁から離れるように引き出します。これにより、肝臓から生殖結節までの内臓を除去します。心臓や肺などの胸腔内の臓器が内臓に付着して一緒に取り出された場合は、次の工程に進む前にそれらを取り除いてください。

腹腔内臓を死体から分離した後、ピンセットを胃に近い肝臓の下に挿入し、腸から肝臓をそっと剥離させます。次に、後腸を背側尿道から慎重に切離し、泌尿生殖器から腸を除去します。最後に、腸を反転させて、胃の下に脾臓が見えるようにします。

脾臓と膵臓を取り除きます。腸間膜を保持して、腸管のループを広げます。次に、腸間膜をそっと引っ張ることで、腸管から腸間膜およびそれに付随する血管系を剥離します。

鉗子で腸を直接掴まないようにしてください。もし腸が切れた場合は、解離ステップで分離した断片をまとめて処理してください。組織の種類と胚の表現型タイプに従って、氷冷HBSSを入れた15 milliliterコニカルチューブに、各組織タイプをまとめて回収してください。

ペレット化した後、分取した組織からHBSSを可能な限り吸引して取り除きます。次に、組織ペレットを1〜数mLのACU maxに再懸濁します。なお、各サンプルの間でピペットチップを交換してください。

組織型のクロスコンタミネーションを避けるため、チューブを37 °Cのウォーターバスに20～45分間置きます。単離する組織の段階によっては、組織の過剰な解離を防ぐための組織の解離およびろ過が、本手順の中で最も困難な工程となります。その結果、細胞生存率が低下することがあります。

解離時間は制限し、途中で組織片を完全に解離させようとしないでください。解離時間の終了時に、チューブをウォーターバスの側面に強く叩きつけ、手首をスナップさせる動作でチューブを振り下ろして、手動で組織を砕きます。次に、解離させたサンプルを氷上に移動させ、各サンプルに新しいピペットチップを使用して、調製したばかりのクエンチ液を1 mLずつ直ちに追加します。組織がほぼ完全に解離するまで、サンプルをピペッティングして混ぜ合わせます。

次に、エタノール滅菌したピンセットを使用して、38 µmのナイロンメッシュメンブレンを3 cm四方に切り取り、新しい15 mLコニカルチューブの口に装着します。次に、ナローボアチップを用いて、再懸濁した個々の細胞溶液をメンブレンの中央にピペッティングし、メッシュでろ過します。細胞懸濁液のろ過が完了したら、サンプルチューブを1 mLのquench 1:5で洗浄し、残っている細胞をすべてろ過します。

次に、ろ過されていない組織サンプルがチューブに入らないように注意しながら、メンブレンを取り除きます。ペレット形成後、細胞懸濁液の上清を吸引し、ペレットを1 mLのクエンチ溶液（1:5）で再懸濁します。その後、図に示したように、各細胞懸濁液をナイロンメッシュを用いて5 mLポリスチレンチューブにろ過します。

まず、EGFPのみの補正コントロール用に、蛍光サンプルの少量を分注して取り分けておきます。次に、野生型組織サンプルを2つの部分に分け、一方に「野生型のみ」、もう一方に「7 A a d.Only」とラベルを付けます。続いて、すべてのサンプルチューブにquench 1〜5を満たし、サンプルをペレット化した後、各チューブの上清を最後の200 µL以外すべて吸引して除去します。

最後に、ソート予定のサンプルと7-AADのみのコントロールに7-AADを添加します。次に、1.5 mLマイクロ遠心管にトリアゾールLSを0.75 mL加えます。サンプル回収チューブを用い、まずコントロールサンプルを使用して補正パラメータとゲートを設定し、7-AAD陽性の死細胞を除外して、高強度のGFP蛍光を示す細胞を回収できるようにします。

コンペンセーションパラメータの設定後、ワイドボアノズルと低流速を用い、可能な限り低い圧力でソーティングを開始します。triol LSが過剰に希釈されないよう、各マイクロ遠心チューブに最大25,000個の細胞を回収してください。ソーティング直後、triol LSに回収された細胞を含む各チューブをボルテックスします。

最初の図では、受精後15.5日のユーロ（Euro）の生殖管全体を腹側から明視野照明で観察した様子を示しています。同じサンプルを蛍光照明下で観察し、TH EGFPトランスジェン発現によって特定された副腎および中央に位置する腹腔神経節におけるEGFP陽性細胞の分布を実証しています。受精後15.5日のTH EGFPの微小解剖された膀胱を側面から見たこの図では、骨盤神経節、膀胱壁、および尿道におけるトランスジェン発現による蛍光が示されています。

この背面観では、前部背面尿道組織にEGFP陽性細胞が認められます。フローソート用の細胞懸濁液を調製するための組織解離は、適切な酵素消化と、細胞生存率の低下を招く過消化の回避との間で繊細なバランスが必要です。これらの顕微鏡写真では、解離時間の半分が経過した時点での下部尿生殖器管および腸管組織を示しています。適切に消化された組織を手動で破砕する前後の写真に見られるように、酵素処理時間が長すぎるか、または酵素濃度が高すぎる組織では、小 dissected された臓器の断片が依然として明確に残っています。

しかしながら、得られた懸濁液には大きな組織片が残っていません。適切な分散処理と手動でのろ過を行うことで、通常90%以上の生存細胞を示すフローサイトメトリープロファイルが得られます。この生存細胞集団の中でレポーターを発現している細胞は、高強度のEGFP発現を維持しています。黒色の集団は、7-AAD蛍光染料を取り込んだ死細胞（単一細胞）で構成されています。灰色の集団は、前方散乱光および側方散乱光に基づいて単一細胞であり、7-AADを排除しているため生存している細胞で構成されています。

緑色の集団は、ゲート設定されたGFP陽性領域からのものであり、7-AADを除外した生存単一細胞で構成され、EGFP蛍光を示します。この手順を用いることで、交感神経鎖、後根神経節、あるいは肺などの他の末梢組織から神経前駆細胞を単離することが可能となり、集団間における遺伝子発現プロファイルの違いや、異なる系統の発達に関する疑問を明らかにすることができます。