吸引脂肪から採取した脂肪由来間質細胞を使用したクリティカル·サイズの頭蓋冠欠損モデルの修復

本手順の全体的な目的は、マウスの生体内（in vivo）頭蓋骨欠損モデルを用いて骨分化を行うために、脂肪組織から多能性間葉系幹細胞を回収することです。まず、脂肪吸引後に得られる脂肪組織の血管間質画分から前駆細胞を単離します。次に、3次元的な基盤（バックボーン）を調製し、その足場（スキャフォールド）に細胞を播種します。

最終ステップは、ラットモデルにおいて、スキャフォールドと細胞を配置するための臨界サイズの頭蓋骨欠損部を作製することです。最終的に、脂肪組織から単離した多能性間葉系幹細胞が、in vivoにおける骨格再生能を有することが示されました。骨格再生に利用可能な組織が不足しているため、本手法の応用範囲は臨床的に非常に幅広いと考えられます。

自家骨移植はゴールドスタンダードである一方、採取部位の不足や採取部位における合併症がこの選択肢の制限となっている。同種移植や人工材料も使用可能だが、コスト、統合性の低さ、および感染のリスクが制限要因となる。

骨組織工学のための前駆細胞の分離に、脂肪組織を利用できる可能性は非常に期待されています。本手順のデモンストレーションは、私とlong anchor laboratoryのMichael Chungが行います。まず、任意の手術による脂肪吸引処置から、ヒト皮下脂肪組織を入手します。

脂肪吸引液に2つの層ができていることに注目してください。上清には、処理された細胞物質の大部分が含まれています。底層の大部分は注入された生理食塩水です。

脂肪由来間質細胞はどちらの層からも回収可能ですが、上澄み液からの収率は大幅に高くなります。間質血管画分（SVF）を単離するには、まず脂肪吸引液を、2.5% Betadineを含む1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）と同量で十分に洗浄し、次にBetadineを含まない1×PBSと同量で吸引します。その後、洗浄液を沈殿させます。

処理済みのヒト組織による汚染を防ぐため、全工程を通じて無菌操作を徹底してください。次に、各洗浄後に下層を吸引して廃棄します。その後、15 mLの脂肪組織を50 mLのFalconコニカルチューブに分注します。続いて、0.075%のフィルター済み溶液15 mLで脂肪組織を消化します。

Hank's平衡塩溶液（HBSS）中のタイプ2コラゲナーゼを、恒温水槽を用いて37 °Cで60分間、絶えず撹拌しながら反応させ、15分ごとに必ずチューブ内の換気を行ってください。その後、10%胎児牛血清（FBS）を含むPBS 15 mLを加えて酵素活性を中和し、遠心分離します。これにより高密度のSVFペレットが得られますが、このペレットは脂肪由来幹細胞と赤血球の混合物となります。

まず上層の脂肪層を取り除き、次にペレットを乱さないように上清液を除去します。ペレットを10 millilitersの標準的な増殖培地で再懸濁します。その後、3本のチューブの内容物を100 micronフィルターを通して1本の清潔な50 milliliterコニカルチューブにまとめ、遠心分離を行います。

ペレットを乱さないように上澄み液を除去し、その後、ペレットを再懸濁します。従来の増殖培地 5 mL を使用し、10 cm プレート 1 枚につき 50 mL コニカルチューブ 2 本、または 15 cm プレート 1 枚につき 5 mL コニカルチューブ 5 本に分配します。37 °C、21% oxygen、5% carbon dioxide の条件下で、一晩静置して一次培養を行います。

一晩インキュベートした後、プレートをPBSで洗浄し、付着しなかった残存赤血球を除去します。得られた細胞集団が脂肪由来間質細胞です。自然分化を防ぐため、細胞はサブコンフルエントな状態で維持してください。

37 °C、21% oxygen、および5% carbon dioxideの条件下で培養します。増殖培地において、細胞は通常3〜4日ごとに通常の増殖培地で継代する必要があります。50% confluenceで播種した際に、付属の原稿で説明されている方法でスキャフォールドを準備します。

細胞がサブコンフルエントの状態に達したら、PBSで2回洗浄し、トリプシン処理を行います。細胞数をカウントして定量します。播種にあたり、あらかじめカットした直径4 mmのスキャフォールドに1.5 × 10⁵個の細胞を播種できるよう準備します。

個々のスキャフォールドを96ウェルプレートの1ウェルに配置し、次に、培地20 µLあたり約1.5 × 10⁵ cellsの濃度となるよう、通常の増殖培地で細胞を再懸濁します。この溶液20 µLをスキャフォールドに直接ピペッティングして細胞を播種し、これを細胞培養インキュベーター内に30分間静置します。

30分後、200 µLの培地を加え、細胞をスキャフォールド上で一晩インキュベートします。手術前に、播種時に行うような細胞のスキャフォールドへの接着を確認する必要はありません。十分な数の細胞を播種していれば、その大部分がスキャフォールドに接着します。

生後60日の成体CD-1ヌードマウスを麻酔後、手術部位をベタジンとアルコールで3回滅菌し、マウスの眼球に潤滑剤を塗布します。次に、マウスの頭皮に正中矢状切開を加え、右側頭頂骨を露出させます。鈍い掻爬によって、右側頭頂骨から骨膜を除去します。

次に、右側の縫合線に関連しない頭頂骨に、直径4 mmの片側性全層欠損を作成します。マウスの頭蓋骨の厚さは植込み前で 0.3 mm 未満であるため、ダイヤモンドコーティングされたタインドリルビットを使用し、下層の硬膜を傷つけないよう細心の注意を払ってください。培地由来の成長因子の移行を防ぐため、スキャフォールドを滅菌 PBS で洗浄します。

スキャフォールドを欠損部に配置します。最後に、皮膚を縫合して閉じ、確立された術後プロトコルに従って動物を観察します。マウスにmicro CTを行い、microviewソフトウェアを用いて3D再構成画像を取得します。

Adobe Photoshopを使用して、画像を標準的な高さにサイズ調整します。通常、頭蓋冠再生の測定は2週間ごとに行います。長期的なフォローアップのためのスキャン中、マウスは麻酔状態で保持され、最終的に安楽死させます。

組織学的解析では、マジックワンド機能を使用して頭蓋欠損部のピクセル数を測定します。その後のCTスキャンにより、欠損部の治癒率を決定します。頭蓋欠損部の面積を測定してピクセル数を算出し、それを元の欠損部のピクセル数で除します。欠損部の範囲に沿って複数の切片を作成し、アニリンブルーやペンアロなどの組織学的染色を用いて骨形成を標示します。

Adobe Photoshopを使用して、頭蓋骨欠損部以外のすべての領域を切り取り、マジックツールを用いて欠損領域における新生骨形成のピクセル数を算出し、これをコントロール群または他の変数と比較します。ここに、脂肪由来幹細胞の分離から、その増殖、分化、そしてin vitroおよびin vivoでの利用に至るまでの、脂肪吸引物の採取と適用に関する概要を示します。最下段の画像は、ヒドロキシアパタイトスキャフォールドを介してASCを適用した際の、臨界サイズ頭蓋骨欠損部のin vivoでの治癒過程を示すマイクロCT画像です。

上段に示されているコントロールには、スキャフォールドなしおよび欠損のみが含まれます。中段は、細胞を含まないスキャフォールドを配置した欠損状態を示しています。ここに示されているLSは、micro CTによる骨治癒の定量化であり、A SC群で治癒が有意に促進されていることを示しています。

これは、andalによるA SC群の骨形成の増加を示す組織学的画像です。青色はalのAROM染色を示しています。青色において、骨様組織はpen aromで濃い青色に染色されます。

ここで黄色に染色されている類骨は、GFPでラベル化しスカフォールドに播種したヒトASCであり、2週間後に採取したものです。欠損部位における再生に寄与しているヒト細胞を示すため、GFP標識抗体を用いて染色を行いました。ここでは、2週間後の欠損部位におけるヒト細胞の普及を示す、ヒト核抗原免疫化学染色の結果を示しています。

習得すれば、脂肪組織の処理は4時間以内に完了でき、手術手順はマウス1匹あたり約10分で完了します。頭頂骨は丸みを帯びているのに対し、ドリルは平らであるため、4 mmの欠損部の全周を確実に穿孔できるよう注意が必要です。脳の硬膜を傷つけないよう、ゆっくりと作業してください。

このビデオを視聴することで、脂肪組織から前駆細胞を分離する方法について十分に理解できるはずです。これらの細胞をスキャフォールドに播種し、マウスに移植します。