隔離された心筋細胞の細胞機能に対する抗体の効果測定

本実験の全体的な目的は、拡張型心筋症またはその他の自己免疫的背景を持つ心疾患患者の血漿中から、心向性抗体を検出することです。これは、まず患者の血漿をanti IgG spherosカラムでミニ免疫吸着させ、第2段階として免疫グロブリンGを精製することによって達成されます。このバイオアッセイの細胞基盤として、成体Wistarラットから心室心筋細胞を単離します。

次に、心筋細胞をチャンバーのカバーガラスに接着させ、収縮時の細胞内カルシウム一過性変化を観察できるようにURA 2:00 AMで染色し、その後、患者のIgGを添加して心筋細胞の収縮能への影響を検証します。この結果から、単離した心筋細胞における収縮能とカルシウム一過性変化の変化に基づき、患者のIgGにトロピック抗体が含まれているかどうかが判定されます。抗体検出のための標準的な免疫測定法などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、特定の抗原に依存せず、刺激性抗体と遮断性抗体を区別できることです。

この手順のデモンストレーションは、当研究室による技術支援を受けて行われます。この手順を開始するには、空のEconoPakカラムに、患者のEDTAプラズマ2 mLあたり3 mLのanti-IgG sphereを充填して、ミニ免疫吸収カラムを準備します。次に、anti-IgG sphereの上にフィルターを配置します。

カラムの下端を切り開き、フィルターを押し込んで、流速が約1秒に1滴になるように調整します。次に、0.9%塩化ナトリウム溶液を1回分の血漿量で3回、カラムに流して洗浄します。血漿がanti IgG Spherosに完全に浸漬されたら、同量の0.9%塩化ナトリウムで洗浄します。続いて、pH 2.8の0.2 Mグリシン塩酸塩を1回分の血漿量でカラムに注入し、粒子に浸漬させます。

次に、同量のグリシン塩酸塩をカラムに加えます。流出液を15 mLチューブに回収し、pH 8.0の0.5 M Tris-HClを用いてpHを7.3に調整し、カラムを再生させます。最後に0.9%塩化ナトリウムを2倍量で洗浄した後、グリシン塩酸塩を3プラズマ量で洗浄します。

このカラムは、心筋細胞に使用する次の血漿サンプルのために再利用可能です。回収したIgG画分は、まず分子量カットオフが100 kilodaltonsのセルロースエステル透析膜チューブにIgG画分を満たし、実験用バッファー（EB）に対して透析する必要があります。次に、チューブを1 literのEBに入れ、4 °Cでマグネチックスターラーを用いてゆっくりと攪拌します。8時間後、透析チューブを3 litersの新しいEBに移し、4 °Cでさらに20時間透析を行います。

サンプルをウォーターバスを用いて57 °Cで30分間煮沸します。補体因子を不活性化させるため、総IgG濃度を測定し、それぞれに330 µgのIgGを含む分注液を調製します。この手順では、付属の原稿に従ってカルシウムフリー分離バッファーを調製してください。

次に、恒温ランノー灌流システムの側上部リザーバーにIBを80 milliliters充填し、バッファーを37 degrees Celsiusに保持し、95%oxygen、5%carbon dioxideで30分間エアレーションします。約7,000から10,000 unitsのコラゲナーゼ type twoと174 milligramsの脂肪酸フリーBSAを、112.5 micromolarの塩化カルシウムを含む20 millilitersのIBに溶解し、必要に応じて上部リザーバー内の分離バッファーのpHを調整します。

次に、チオペンタール（375 µg/kg）を用いて体重175〜200 gのWistarラットを麻酔し、その際、チオペンタール溶液に2,500 IUのヘパリンを添加します。開胸後、大動脈弓を温存したまま慎重に心臓を摘出し、氷冷した0%塩化ナトリウム溶液に移します。心臓から血液および周囲の組織を取り除きます。

次に、新鮮な0.9% sodium chlorideに移し、大動脈を露出させます。Langorシステムの流量調整器をオンにし、1秒間に2〜3滴の滴下速度に調整します。その後、心臓をカニューレに接続します。

残存する血液を洗い流すため、1秒間に1滴の流速で最大3分間灌流します。その後、LORシステム内でIBを循環させます。次に、上部リザーバーから20 millilitersのバッファーを取り除きます。

リザーバーにコラゲナーゼ溶液を満たし、80 millilitersになるまで必要な量の緩衝液を追加します。その後、消化液をさらに27分間循環させます。次に、カニューレから心臓を切り離します。

心房と大動脈を取り除き、心室を細かく刻みます。消化バッファーを下部リザーバーに流し込みます。液量を最大40 millilitersまで減らし、95%oxygen、5%carbon dioxideで絶えず通気しながら、刻んだ心室をさらに10～15分間消化します。

その後、細胞懸濁液を200 micronメッシュサイズのガーゼでろ過し、50 milliliterチューブに回収します。最後に、細胞懸濁液を40 3Gで2分間遠心分離し、細胞のカルシウム含量を回復させます。室温で、細胞を10 millilitersの溶液に再懸濁します。

200 µM 塩化カルシウムを含むIBを再度遠心分離し、500 µM 塩化カルシウムを含む10 mLのIBに細胞を再懸濁します。最終遠心分離後、心筋細胞を滅菌ろ過済みのEBに再懸濁し、密度を50,000 cells/mLに調整します。

4ウェルチャンバーのカバーガラスに、1ウェルあたり10 µgのラミニンをコートし、完全に乾燥するまで待ちます。次に、各ウェルに心筋細胞懸濁液を1 mLずつ注入します。チップの先端をカットしたマイクロピペットを用いて、室温で1時間、細胞を接着させます。1 mg/mLのfira 2:00 AMストック溶液10 µLを5 mLのebで希釈し、染色溶液を遮光して保存します。

次に、カバーガラスからバッファーと未付着細胞を取り除き、染色液を0.5 millilitersピペットで分注します。各ウェルで、適度に振盪しながら細胞を10分間インキュベートします。その後、染色液を取り除き、1 milliliterのebで細胞を1回洗浄します。

次に、この手順に従って各ウェルに0.5 millilitersのEBを加え、カバーガラスを心筋細胞のカルシウムおよび収縮能記録システムに接続された倒立蛍光顕微鏡下に配置します。流入チューブと流出チューブを備えた特注の電極を最初のウェルに設置し、1 milliliter per minuteのebで心筋細胞を灌流します。

電気刺激を20 V、1 Hz、パルスあたり5 msの持続時間で開始し、約2分間、細胞を刺激に順応させます。横紋が明瞭で、一定の収縮を示す無傷の棒状心筋細胞を選択し、視野の中心に配置します。次に、カメラチャンネルを開き、細胞フレーミングアダプターの回転および顕微鏡ステージの移動によって、ビデオエリア内で細胞を水平に方向付けます。

ビデオ領域の検出コントロール要素の境界を調整します。蛍光チャンネルをオンにし、10〜15回の収縮を記録して、初期の細胞短縮およびカルシウム・トランジェントを取得します。その後、蛍光染料の退色を防ぐため、顕微鏡の光源チャンネルをオフにします。

3方弁を用いて、流路をEBからサンプルバイパスに切り替え、心筋細胞を1 mLの患者IgGで超融合させます。空気がウェルに到達する直前にポンプを停止し、ライトチャンネルをオンにして、さらに10〜15回の収縮を記録し、急性細胞応答を取得します。その後、記録を一時停止して再びライトチャンネルをオフにし、2分後と5分後に記録を繰り返します。記録が終了したら、ウェルから電極を抜きます。最後に、IonWizardソフトウェアを使用し、それぞれedge length/lengthおよびURA2 numeric subtracted/ratioウィンドウを用いて、細胞短縮とカルシウムトランジェントを解析します。

次に、初期の細胞短縮およびカルシウムトランジェントのピーク高さに対する、急性、2分後、および5分後の反応のパーセント変化率を算出します。以下はコントロール測定の代表的な例です。細胞短縮とカルシウムトランジェントは、IgGの灌流前、およびIgG灌流直後、2分後、5分後にオンラインでモニタリングされました。

ここでは、心抑制抗体を含むIgGサンプルの測定例を示します。細胞短縮とカルシウム過渡現象を、IgGの灌流前、および灌流直後、2分後、5分後にオンラインで測定しました。このビデオを視聴することで、単離した成人ラット心筋細胞の細胞短縮とカルシウム過渡現象に対する単離IgGの影響を測定し、患者血漿中の心抑制抗体を検出する方法について十分に理解できたはずです。