DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

本デモンストレーションでは、2Dおよび3Dライブセルイメージングを用いて、DNA損傷応答に関与するタンパク質の時空間的な関係を解析します。まず、適切な蛍光マーカーを含む発現コンストラクトを、任意の細胞株にトランスフェクションまたはトランスダクションします。ここではM CherryとGFPを使用します。次に、正常条件下における蛍光標識細胞の一連のコントロールビデオを取得します。

次に、適切な処理を行い、蛍光細胞のプロセスに対する処理効果のデータを取得して、タンパク質の時空間的な関係についてビデオデータを解析します。最終的に、生細胞蛍光顕微鏡法を用いることで、DNA損傷剤に対する53 BP1フォーカスの形成や、有糸分裂中の53 BP1の挙動といった細胞ダイナミクスを詳細に明らかにできます。私たちは、特定の細胞株において様々な処理が有糸分裂にどのように影響するかを研究したいと考えたとき、初めて2Dおよび3Dのライブセルイメージングに関心を持ちました。

この実験的アプローチにより、従来の法よりも容易にDNA損傷応答およびゲノム安定性の維持を研究することが可能になります。さらに、この手法を用いて、さまざまな細胞株や多様なシグナル伝達経路において特定のタンパク質がどのように相互作用するかを研究できます。サイトケミストリーのような従来技術に対するライブセルイメージングの主な利点は、DNA損傷応答タンパク質をリアルタイムで研究できる点にあります。

適切な記録条件の最適化は困難を伴う場合があります。本デモンストレーションは、成功を確実にするために必要な多くの細かなステップを確認するために活用できます。光退色を最小限に抑え、適切な記録間隔や記録時間を決定する場合などは、根気強く取り組むことが成果につながることを忘れないでください。

mCherryおよびGFP融合タンパク質発現用のプラスミドを用いて、適切な細胞株にトランスフェクションまたはトランスダクションを行います。薬剤選択条件下で培養を維持し、画像取得の前日に蛍光タンパク質の発現を定期的に確認します。トリプシンを用いて細胞を回収します。

次に、低密度の培養物を3.5 centimeterフルオロディッシュガラスボトムプレートに播種します。本プロトコルは、axio observer Z oneスタンドを備えたZeiss cell observer SDスピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて開発されました。まず、CO2ガスがインキュベーションシステムのCO2モジュールに供給されていることを確認してください。顕微鏡が除振エアテーブルに設置されている場合は、エアテーブルのエア供給をオンにします。

次に、顕微鏡スタンド、スピニングディスクユニット、カメラ、インキュベーションモジュール、HXP照明装置、電動ステージ、アルゴンレーザー、およびコンピュータの電源を入れます。使用するレーザーラインのスイッチをオンにします。Axio visionソフトウェアを起動します。

Avisionソフトウェアは、顕微鏡およびそれが制御するコンポーネントに特化したウィンドウやプルダウンメニューを用いてカスタマイズすることができます。そのため、ユーザーインターフェースの外観はそれぞれ異なる可能性があります。イメージングの約1時間前に、インキュベーターのコントロールを確認し、上部チャンバーとステージプレートの加熱を開始してください。

温度を37°Cに設定します。CO2コントロールをオンにし、レベルを5%に設定します。本研究で使用するイメージング用の対物レンズを選択します。この対物レンズには、水に近い屈折率を持つ浸液の使用が必要です。

長期間にわたって複数の位置をイメージングする必要がある場合は、鏡筒が乾燥しないよう、十分な量の浸漬媒を適用してください。培養皿をステージに置き、顕微鏡のコントロールまたはソフトウェアを使用して、対物レンズを底面に接触させます。放出光を接眼レンズに向け、目的の蛍光シグナルに適したワイドフィールドフィルターセットを選択します。

次に、接眼レンズから覗きます。ソフトウェアまたは顕微鏡のコントローラーを使用して、像にピントを合わせ、適切な細胞の視野を特定します。ソフトウェアで、放出光を接眼レンズから共焦点スピニングディスクユニットが搭載されたポートへ切り替えます。

本研究に適したレーザーをオンにします。各チャンネルについて、Kuo光学可変フィルターコントロールを調整し、レーザー強度を適切なレベルに設定します。次に、適切なダイクロイックミラーとエミッションフィルターを選択します。

スピニングディスクユニットのシャッターを開きます。次に、ライブウィンドウを選択して現在の視野を表示させます。続いて、カメラコントロールウィンドウを開きます。

使用するカメラを選択し、露光時間を約100 millisecondsに設定します。必要に応じて、パーセントおよびEMゲインを調整してください。また、共焦点スピニングディスクユニットのコントロールを開き、適切な画像を撮影するために設定したカメラの露光時間を入力して、スピニングディスクの速度を調整します。

「set」をクリックして変更を確定させます。次に、多次元イメージング取得ウィンドウを開きます。「channel」タブを選択し、Flora Fours用に定義された適切なチャンネルをロードまたは選択してください。

画像のレジストレーションを確実にするため、両方のチャンネルで共通のダイクロイックミラーを使用します。ソフトウェアをオートフォーカスに設定してください。MDAウィンドウに移動し、ZS stackタブをクリックします。

現在のフォーカス位置でZSスタックを選択します。10 micronのZスタックの範囲を設定し、Z方向のナイキストサンプリングを確保するために最適なステップ数を選択します。次に、「Start」をクリックし、得られたZスタック画像を解析します。「Time」タブを選択してください。

イメージングの時間間隔とセッションの全時間を設定します。ディッシュ内の複数の細胞をマルチポイントイメージングする場合は、MDAウィンドウを開きます。Positionタブを選択し、「apply setting before or after time point per position」にチェックが入っていることを確認してください。

次に、「mark」を選択します。ライブビューを使用して、ディッシュを移動させながら適切な視野を選択してください。多次元取得メニューの「start」をクリックして実験を開始し、コントロールビデオを記録します。

適切な処置を加え、定められた時間間隔で一定期間、実験動画を記録します。この細胞株を用い、有糸分裂の全過程をモニタリングする場合、間隔を7分30秒とし、4〜5時間記録しました。使用する細胞株および研究目的に応じて、最適な設定を決定してください。

Velocityソフトウェアを起動し、新しいライブラリを作成して名前を付け、閲覧するために実験ビデオファイルをインポートします。拡張フォーカス（extended focus）設定を試し、必要に応じてビデオを調整してください。Velocityには、取得した画像の品質を向上させるためのさまざまなツールが備わっています。

顕微鏡の設定を適切に行っておけば、後の編集時間を大幅に短縮できます。多くの場合、画像のデコンボリューションを行い、輝度とコントラストを調整することが有用です。具体的な調整内容は実験によって異なります。細胞を3Dで観察するには、3D不透明度設定に切り替えてください。

これにより、3Dレンダリングされた細胞を空間内で回転させることができ、細胞内の目的の構造をさまざまな視点から観察することが可能になります。動画および静止画は、ユーザーの好みに応じてさまざまなファイル形式でエクスポートできます。コントロール群と比較して、CPTに曝露した線維芽細胞は5〜10分以内にフォーカスを形成し、記録期間中、これらのフォーカスが維持されました。

興味深いことに、ヒト胚性腎細胞では、有糸分裂の開始時に 53 BP1 がクロマチンから解離し、凝縮する染色体の周囲に薄いヘイズを形成します。その後、テロフェーズ（終期）が起こり有糸分裂が終了すると、53 BP1 は再び明確なフォーカスとして凝集します。このビデオが、DNA損傷応答に関与するタンパク質やその他のパスウェイの時空間的な関係を研究する一助となることを願っております。

例えば、クロマチンダイナミクスの分野では、この技術を用いて53BP1の結合がDNAのテロメア末端の移動にどのように影響するかを研究しました。遺伝子改変細胞の作製後、2Dおよび3Dの生細胞イメージングを約4〜8時間で行うことができます。最適なイメージングを行うために、顕微鏡の設定が適切に調整されていることを確認してください。