軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

本実験の全体的な目的は、単一の神経細胞における膜電位信号の統合および情報処理を、ニューロン上の複数の部位からサブマイクロメートルおよびサブミリ秒の解像度で光学的にモニタリングすることです。これは、まず、膜電位の過渡的な変化に対応する光強度のわずかな分率変化を記録できる適切な感度を備えたイメージングセットアップを構築することで達成されます。次に、単一の焦点面内でスライス表面近くに長く無傷な突起を持つ、効果的なイメージングに適した形態のニューロンを選択します。

次に、膜電位の変化を光学的に追跡できるよう、あらかじめ選択したニューロンに電位感受性色素を導入します。結果として、軸索、樹状突起、および樹状突起スパインからの膜電位信号をモニタリングすることにより、個々の神経細胞による電気信号統合に関する情報を取得できるという、本アプローチ独自の能力が示されます。細胞神経生理学において。

従来の電気生理学には、電極測定の空間分解能が低いこと、および軸索側枝や樹状突起スパインのような微小構造からの記録が不可能であるという2つの長年の限界があるため、新しいツールの開発が進められています。これらの欠点を克服するために、パッチ電極法を光学的手法と組み合わせることで、ニューロンのあらゆる部位から並行して記録することが可能になります。本稿では、単一スパインの分解能で膜電位の一過性変化を多点光学的に記録するこのような手法について説明します。

本実験では、正立顕微鏡と3台のカメラを使用して、均一な照明になるよう調整します。まず、レーザー光路に適切なニュートラル密度フィルターを挿入します。次に、標準蛍光スライドの表面に目的レンズの焦点を合わせます。

モニター画面上で視野のCCD画像を確認しながら、エピ蛍光コンデンサーの適切なアクチュエータを使用して、石英ライトガイドの受光端およびライトガイドの出力端の位置を調整し、視野の中心に均一な照明が得られるようにします。振動ノイズを測定するには、表面に非蛍光標識がある標準蛍光スライドを使用します。neuro CCDを用いて、連続モードで光強度を記録します。

対物レンズを黒いマークの暗いエッジに合わせ、フレームレート2 kHzで約100ミリ秒間、光強度を記録します。次に、均一に照明された領域から光を受けている約20ピクセルと、黒いマークのエッジに沿った約20ピクセルからの、分率光強度トレースの空間平均を表示します。高コントラストのエッジを持つピクセルの空間平均における過剰ノイズは、システム内の振動ノイズを反映しています。

シャッターの開放による振動ノイズが光学記録に混入しないよう、メカニカルシャッターは必ず除振台の外側に設置してください。これは極めて重要な手順です。光学記録システムに捉えられる可能性のある音響振動ノイズを低減するため、プラスチック製のネジと除振材を使用してシャッターを固定してください。

振動を隔離するために、画像の鋭いエッジ部分を覆うピクセルの振動ノイズがショットノイズよりも小さくなるまで、除振台を調整します。機械的な振動が顕微鏡本体に伝わるのを避けるため、台上の機器の配線には余裕を持たせてください。この手順では、回転円盤共焦点システムを用い、目的の個々の神経細胞にEGFPを発現させたマウス系統を用いて、標準的な手順に従って厚さ 300 to 400 micron の脳切片を準備します。

スライス内のEGFP標識ニューロンを可視化します。次に、膜電位イメージングを行うため、樹状突起および軸索の樹状構造が保持されており、突起がスライス表面に平行かつ近接して走行しているニューロンを選択します。その後、約15秒間陰圧をかけることで、ガラスパッチピペットの先端から電極テーパーの3分の2まで、色素を含まない細胞内液を満たします。

その後、細胞内液に溶解した膜 IMP 透過性電位感受性色素を含む溶液を電極に充填します。色素を電極に充填してから1分以内に、あらかじめ選択しておいたニューロンにパッチクランプを行います。ピペットをバスに浸す前に、約 10 mmHg の低い正圧をかけます。スライス内で電極を配置する際にこの圧力を維持することで、シールが形成される前に色素が電極から漏れ出すのを防ぐことができます。

電極が細胞表面に接触する直前に、圧力を水銀柱100 millimeters of mercury程度の高圧まで上げます。ホールセル構成でシールを形成し、体細胞パッチピペットから細胞体に染料が自由拡散するように20 to 45 minutes間保持します。染料の拡散中、カレントクランプモードで誘発活動電位を記録し、ニューロンの生理学的状態をモニタリングします。

さらに、2 kHzのフレームレートで、ニュートラル密度フィルタで調整した最大光強度の数分の一の強度を用いて細胞体からの静止光強度を記録し、染色の程度をモニターします。活動電位の幅が広がり始めるまでダウンロード処理を継続してください。染色終了後、ホールセル構成からアウトサイドアウトパッチ構成へ確実に移行させるため、ボルテージクランプ構成のままパッチピペットを細胞体から慎重に引き離します。

次に、電位感受性色素が神経突起まで広がるように、切片を室温でさらに1.5～2時間インキュベートします。十分な量の色素が細胞体から樹状突起および軸索突起へと拡散すると、活動電位の波形が完全に回復します。次のステップでは、低強度の蛍光下で染色されたニューロンの細胞体を特定します。

NDフィルターを用いて光強度を下げ、XYステージを使用して目的の物体を可視化するために必要な最小限の強度に調整します。蛍光ニューロンを含むスライス領域をスキャンし、蛍光細胞体を確認します。染色された細胞の細胞体を顕微鏡視野の中心に配置し、DIC下で色素を含まない標準的なパッチ電極を用いてニューロンにパッチクランプを行います。その後、電圧イメージングのため、CCDの連続記録モードを用い、10から40Hzのフレームレートで低強度の蛍光下でニューロン突起を可視化します。

XYステージを用いて、イメージング領域の中央に目的の神経突起を配置します。さらに、光力学的損傷を軽減するため、顕微鏡のフィールドストップ・アイリスを部分的に閉じて、SOMAを励起光から保護します。次に、個々の樹状突起分枝における逆伝播活動電位に関連する光学信号を記録します。

次に、軸索における活動電位に関連する光学信号を記録します。その後、樹状突起スパインにおける逆伝播活動電位に関連する光学信号を記録します。信号波形を正確に再構成するために、適切なフレームレートを使用してください。

同時に、色素の退色と光力学的損傷を最小限に抑えるため、記録期間および高強度励起光への曝露時間は可能な限り短くしてください。ここでは光学信号の記録を示します。上パネルは、記録位置にある軸索を備えた染色済みニューロンの高解像度共焦点画像を示しています。

中央のパネルは、膜電位イメージングに使用したCCDで得られた軸索の低空間分解能蛍光画像を示しており、下のパネルは、細胞体からの電極記録、およびA ISおよびrvi結節からの光学記録を示しています。ここでは、生データと処理後の信号が表示されています。この図は、電位感受性色素をロードしたL5皮質ニューロンの軸索からの活動電位信号を示しています。

潜在的な関連信号を10 kilohertzのフレームレートで記録しました。これらのトレースは、3つの部位における活動電位のトランジェントを示しています。1つ目は、細胞体から記録した電極によるものです。

2つ目は軸索丘からの光学記録、3つ目はfirst node of Ranvierからの光学記録であり、ここにあるのはこれら同じ3箇所からの重ね合わせ信号です。この図は、100 Hzの短時間の脱分極電流パルスによって誘発された、L5皮質ニューロンの樹状突起樹上の複数の部位からの4回の逆伝播活動電位信号のバーストを示しています。ここに示されているのは、個々の樹状突起スパインからの活動電位信号です。

こちらが、スピニングディスク共焦点顕微鏡画像のスタックから得られた解剖学的再構築図であり、こちらがCCDカメラで撮影した同一領域の蛍光画像です。膜電位イメージングについて、CCD画像に示された位置1から3における逆伝播活動電位に対応する蛍光強度トレースを右パネルに示します。最下段のトレースは、細胞体から記録した電極のデータを示しています。

記録前の準備には、ダイスの遠位突起への拡散待ち時間を含め、約3時間かかります。記録時間は、標本の通常の劣化およびPO光力学的損傷によって制限されます。光力学的損傷の程度は、励起光の強度、ならびに個々の記録試行の持続時間と回数に比例します。

実験によっては、1〜2時間で50回以上の記録試行を行うことが可能です。一方で、高い励起や光強度を必要とする測定や、より長い記録時間を要する測定では、光力学的損傷によって記録試行回数が数回に制限される場合があります。このビデオを視聴することで、脳切片中の個々のニューロンにおいて、軸索および終末構造全体から電圧イメージングを行う方法を十分に理解できるはずです。