ラットの脳から脳表面血管系および関連髄膜の解剖と脈絡叢のビジュアル解説

この手順の全体的な目的は、前脳皮質、中脳、視床、および脳梁の表面を覆う髄膜の硬膜および蛛網膜部位と、それに付随する動脈系を効率的かつ迅速に解剖し、さらに側脳室から脈絡叢を採取することです。これは、まず松果体を摘出し、前脳に接する髄膜と動脈樹を分離することで達成されます。次に、ウィリス動脈輪の腹側から始めて、皮質表面の動脈および細動脈を慎重に除去し、その後背側の皮質表面へと進めます。その際、硬膜および残りの蛛網膜が血管系に付着したままとなるようにし、隣接する皮質表面組織の採取を最小限に抑えます。

次に、皮質と交連繊維を中隔および海馬から剥離して側脳室を露出し、脈絡叢を採取できるようにします。最後に、海馬を除去して、視床と中脳の脳梁を露出させます。その後、この領域を覆っている髄膜および関連する血管系を剥離します。

最終的に、摘出した髄膜および関連する動脈血管系、ならびに脈絡叢の完全性と特異性は、これらの各領域の遺伝子発現プロファイルを比較することで判定できます。この手法は、脳機能を支持する血管に関連する研究における重要な疑問への回答に役立ちます。これには、血流、CSF機能、神経毒性による損傷、および脳外傷に関して、脈絡叢の機能と髄膜およびその関連動脈血管系との間の類似点、比較、および相違点が含まれます。

本プロトコルの開始にあたり、安楽死させた直後のラットから摘出した脳を、氷冷した生理食塩水に5分間浸します。解剖前にこの時間冷却することは、脳膜およびそれに付随する動脈血管系（MAV）を皮質の表面から分離させるために重要です。次に、氷上に置いたガラス製ペトリ皿の底に脳を置き、1 cmの氷冷生理食塩水または0.1 M リン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（pH 7.4）を加えます。

すべての解剖操作は、脳の大部分を生理食塩水に浸した状態で行ってください。解剖を開始するには、脳の背面を上にしてペトリ皿に置き、両半球間の最も腹側にある正中領域に位置する松果体を特定します。松果体は、小脳の直前（吻側）、および髄膜の直下または表面に位置しています。

colli（頸部）の上方を確認します。2本の小さな曲がった先端のピンセットを用いて、松果体を摘出します。松果体は皮質と同様にピンク色をしていますが、脳の摘出時に残った血液や血管の残渣に囲まれていることが多い点に注意してください。

次に、シャーレの中の脳を裏返します。続いて、橋を覆っている椎骨動脈と小動脈および髄膜を、前脳の髄膜および血管系から分離します。次に、MAVの除去を開始します。

解剖工程では、ウィリス動脈輪の主要動脈である中大脳動脈および前大脳動脈から、腹側より開始することが重要です。次に、いずれかの半球から始めて、小型の曲先ピンセットを用いて内頸動脈の接合部の直後にある後交通動脈を切断し、これにより前脳の前方および後方の動脈系を分離します。その後、対側半球に対しても同様の手順を繰り返します。

次に、ピンセットでMCAと前大脳動脈を把持し、腹側前頭皮質を覆っているAVMが嗅球を乗り越えて周囲に回るように、前背側方向へゆっくりと牽引します。これにより、前頭皮質を覆っていたAVMの大部分が取り除かれます。脳をペトリ皿に対して45度から90度の角度に回転させ、側頭皮質領域を囲むAVMのより前方の外側領域を皮質から分離できるようにします。その後、MCAと関連する動脈を把持し、皮質に沿って背側へゆっくりと牽引します。

必要に応じて、解剖中にピンセットの先端を使用して、主要動脈を皮質から持ち上げて剥離させます。次に、AVMのより後方の外側領域を除去します。この採取プロセスにおいては、AVMの冷却と保湿を維持するため、左右の半球を交互に作業することが最適であることに注意してください。また、AVMを皮質から剥離させる際に抵抗がある場合も、半球を切り替えてください。

最後に、一次体性感覚野および運動野を囲むMAVの最も背側の領域を除去するため、脳を背側が上になるように向け、この部位を脳から切り離します。この際、正中静脈に沿ってピンセットの先端を使用してください。採取したMAVのこの部分は、試験や分析に必要になるまで氷冷生理食塩水に一時的に保存するか、後で処理するために冷凍保存します。多くの場合、皮質の最も後方の領域を覆うMAVは付着したままとなります。

その除去方法は、本ビデオの後のセクションで説明します。脈絡叢を除去するには、まず脳を背側が上になるように配置し、大きめのピンセットで固定します。次に、小さめのピンセットを大脳半球間の正中線に沿って押し込み、その先端で皮質と脳梁を貫通させ、海馬の正中線上部にまで到達させます。

次に、ピンセットを用いて、脳梁を伴う皮質を背側海馬および中隔から引き離し、側脳室の大部分を露出させます。脈絡叢は、その全長に沿って走る主要動脈を示す波状の赤い線によって位置を特定し、同定することができます。ピンセットの両端を用いて第三脳室の側壁を押し広げ、最も狭い部分を拡大させます。

次に、小鉗子を用いて、脈絡叢のこの端を慎重に引き離します。続いて、鉗子を使用して中隔と尾状核・被殻領域の間の最前方領域を広げ、こちらの端からも脈絡叢を引き離します。また、対側半球でも同様の手順を行い、2つ目の脈絡叢を採取します。

繰り返しになりますが、この組織は氷上、冷所、生理食塩水中で一時的に保存するか、後の処理のために凍結保存することができます。皮質の後方側にある残りのMAVを除去するには、まず、両半球から海馬全体を取り除き、視床および丘上のMAVを露出させます。この部位のMAVの除去は、皮質に残っているMAVの除去よりもはるかに容易であることに注意してください。

視床の前部を覆っている大きな血管系を把持し、慎重に牽引することで、この血管系が上共鳴ネットワークに接続しており、背側海馬および背側視床ネットワークに血液を供給していることがわかります。慎重に牽引し続けると、最終的に上部ネットワークが解放され、側枝動脈輪の最後の部位に到達できます。この時点で、顆粒後線状一次、聴覚、および視覚皮質の表面に残っているAVM（動静脈奇形）を慎重に除去する必要があります。

この2回目の視床および脳梁MAV切片とともに採取された、残りの後腹側皮質MAVは、個別に解析する場合は取り除き、最初に解剖した皮質MAV切片に加える必要があります。次に、対照条件下での線条体、頭頂葉皮質、およびMAV領域間の遺伝子発現プロファイルを比較するために、Agilent 0 1 4 8 7 9 ラット全ゲノム 4×44,060 mer オリゴヌクレオチドアレイを用いて遺伝子発現解析を行うことができます。処理、スキャニング、および初期データ保存に関する詳細は、Thomas et al. を参照してください。

解剖が正しく行われた場合、得られたMAV組織は合計で約35〜45 mgの2つの完全な状態で存在します。最初に解剖した、皮質の大部分を囲むMAVの重量は約25 mgであり、視床、胼胝体、および後頭葉皮質を覆うMAVの重量は約15 mgとなります。

組織は、血管内に残存する血液により、わずかにピンク色を帯びているはずです。採取した両側の脈絡叢は、ここに示されているように、それぞれ1〜2 mgの重量を持つ2つの完全な組織サンプルである必要があります。ここでは、コントロール条件下における線条体、頭頂葉皮質、およびMAVにおける遺伝子発現プロファイルの比較を示しています。

上のグラフは、頭頂葉皮質と比較した線条体における発現を示しています。下のグラフは頭頂葉皮質と比較したMAVにおける発現を示していますが、線条体と頭頂葉皮質はMAVよりも互いに非常に密接に関連していることがわかります。ここでは、対照群と比較した高熱時のMAVにおける遺伝子発現の差、対照群と比較したアンフェタミン投与時の発現の差、および高熱時とアンフェタミン投与時の比較による発現の差が示されています。

最後に、頭頂前頭皮質（MAV）において、頭頂皮質および線条体と比較して15倍以上の発現を示した遺伝子を、機能別に分類した結果を示します。これらの遺伝子の多くは、血管系および免疫系に関連しています。また、極めて大きな変動（fold change）を示したその他の遺伝子には、細胞外マトリックスタンパク質、soluteトランスポーター、ならびに脂質およびレチノイン酸代謝に関与するものがあります。

この手順を行う際は、MAVの解剖時に根気強く取り組むことが重要です。また、解剖の間中、脳を等張生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水に浸した状態に保つことが重要です。さらに、実験データの作成に用いる組織を採取する前に、4〜5匹のラットでMAVの切断練習を行うことを推奨します。