同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

本手順の全体的な目的は、正確な定位座標における光遺伝学的刺激中の、EEG（脳波）で定義される睡眠および乳酸濃度を測定することである。まず、必要な脳波電極リードと、乳酸センサーおよび光ファイバーケーブル用のカニューレを外科的に植え込む。その後、動物の頭蓋骨にあるガイドカニューレに、光ファイバーケーブルとあらかじめ校正した乳酸センサーを挿入する。

次に、目的の電気生理学的反応が得られるように、青色光刺激の強度を調整します。その後、動物に自発的な行動または睡眠を許可した状態で、脳波、筋電図、および乳酸濃度のデータを収集します。EEGの薬理学的研究などの他の手法と比較して、この実験的アプローチは、サブセカンドの時間スケールでニューロンの活動をリアルタイムに操作しながら、脳の生化学および電気生理学をモニタリングできるという利点があります。

したがって、睡眠研究分野に新たな知見をもたらす可能性は非常に高いと言えます。例えば、徐波睡眠に伴う代謝的および電気生理学的な随伴現象を特定することが可能です。この種の実験は、学習と記憶、シナプス可塑性、あるいはてんかん性疾患など、神経科学の他の領域にも応用できます。

この手術手技は技術的な難易度が高く、かなりの器用さが求められますが、練習によって習得可能です。このビデオデモンストレーションでは、記述的な説明を補完するため、いくつかの複雑な手術手順における重要なステップを繰り返し説明します。

動物が手術から回復した後、乳酸センサーと光ファイバーケーブルを適切に挿入することが課題となります。ジョナサンと私は、これら2つの繊細な装置を挿入する際に、動物をしっかりと固定する方法を実演します。最後に、刺激強度をリアルタイムで調整し、EEG反応を最適化する方法を示します。

本実験では、青色光感受性カチオンチャネルを発現する遺伝子組換えマウスを使用します。このチャネルは大脳皮質ニューロンに導入されています。まず、導入には5% isof fluorine、95% oxygenを用い、その後は3% isof fluorine、97% oxygenで麻酔を維持してマウスを麻酔させます。

両目の間から頭蓋骨の後方にかけて、頭頂部に正中切開を加えます。過酸化水素と滅菌生理食塩水で頭蓋骨を洗浄します。電極光遺伝学刺激構成の定位座標を決定するため、BregmaとLambdaを特定して印を付けます。0.5 mmのボールバービット、続いて0.7 mmのボールバービットを装着した高速歯科用ドリルを用いて、ネジ穴を穿孔します。

マイナスドライバーを使用して、電極固定用ネジを穴に挿入します。目的の深さになるまで、約4〜5回転締め込みます。ステレオタキシス用カニューラでガイドカニューラを固定し、アクリルセメントを用いて頭蓋骨およびアンカーに接着します。開通性を維持するため、手術時から実験開始まで、各ガイドカニューラにダミーカニューラまたはスタイレットを挿入しておく必要があります。

EEG電極とガイドカニューラを頭蓋内に配置した後、歯科用アクリルセメントを薄く塗布して固定します。セメントが凝固した後、乾燥したセメントの山の上にプラスチックコネクタを配置し、EEGリードから出ているワイヤーの端をプラスチックコネクタの接点に溶接します（ワイヤーリードがセメントに埋没した場合に備えます）。次に、21ゲージの針のバレルに電極線を滑り込ませることで、筋電図用ワイヤーを目的の筋肉まで導入します。

筋肉を貫通させ、筋肉から出ているワイヤーのすぐ遠位側で、5-0ナイロン縫合糸を用いてダブルサージャンノットを結紮します。筋肉組織にアクセスするために牽引していた皮膚を、リバースカッティングのP3針と5-0ナイロン縫合糸を用い、単結節サージャンノットで縫合します。MC刺激ユニットのプログラムが完了したら、5 Vのバイナリオンオフ信号として、スタンドアロンの信号発生器として動作させます。BNCコネクタを使用して、MC刺激ユニットをレーザーのTTL対応電源ユニットに接続します。

リボンケーブルを使用して、レーザー電源ユニットをレーザーに接続します。また、レーザーを起点となる光ファイバーパッチケーブルのオスFCコネクタに接続します。起点となる光ファイバーケーブルをロータリージョイントに接続します。

光ファイバ・ロータリージョイント（コミュテータ）は、コミュテータとして機能します。動物がケージ内で動き回ると、ロータリージョイントが回転し、回転トルクによる光ファイバケーブルの断線を防止します。プラスチック製結束バンドを用いて、動物が飼育されている円筒形ケージの上に配置した金属スタンドにコミュテータを固定します。

片手でマウスを包み込むように押さえ、マウスを固定します。マウスの頭部を、実験者の中指と人差し指の間に位置させます。次に、滅菌済みの25ゲージ針を用いて、ガイドカニューラ内のデブリを取り除きます。

次に、光ファイバーケーブルを手で挿入し、ネジ付きスクリューキャップで光ファイバーガイドカニューレに固定します。平坦に切断された端端から一定の距離に結んだ縫合糸の結び目によって、脳内への光ファイバーケーブルの挿入深さを制御します。センサーをリン酸緩衝生理食塩水で平衡化した後、3つの濃度のL-lactateに段階的にさらします。

メーカーのプロトコルに従い、あらかじめ校正したセンサーを、光ファイバーケーブルの挿入手順と同様の方法で、頭蓋骨に装着した乳酸ガイドカニューレに挿入します。乳酸センサーを、バイポーラプラグコネクタを用いてPinnacle 8, 400バイオセンサーのプリアンプに接続します。次に、このプリアンプを、外科的に埋め込まれたヘッドマウントの8ピンコネクタに取り付けます。

データを収集する前に、レーザー強度調整ノブを使用して、光遺伝学的刺激の強度を調整します。EEG反応の振幅は、体系的に研究されていない要因により個体間で異なります。したがって、光遺伝学的刺激の強度を調整し、目的の反応が得られた際にEEG反応が適切であることを確認する必要があります。

neuro scoreを用いたPinnacle 8, 400システムを使用してデータを収集します。SEIAインターフェースを用いて、EEGおよびEMGデータの処理結果を視覚的に確認し、睡眠状態を分類します。EEGおよびEMGに基づき、10秒のエポック単位でデータを覚醒、ノンレム睡眠、またはレム睡眠に分類します。

このバイオセンサ・光遺伝学的刺激構成では、外科的に植え込まれたEEG電極、乳酸センサ、および光遺伝学的刺激用のカニューレが示されています。光遺伝学的刺激がない状態で、このマウスは自然睡眠に陥りました。EEG、EMG、および脳内乳酸濃度を継続的にモニタリングしながら、覚醒状態への移行、および2つの睡眠サブタイプを観察しました。

レム睡眠（Rapid eye movement）とノンレム睡眠（non rapid eye movement）は、EEGとEMGに基づいて定義されます。興味深いことに、乳酸バイオセンサーの電流は、低振幅のEEGに応じて上昇し、高振幅のEEGに応じて低下します。EEGの両チャンネルは、前頭皮質に送られた光遺伝学的刺激に反応します。

このビデオを視聴することで、光遺伝学的操作と、脳内の脳波、筋電図、および乳酸濃度の同時測定を行うためのマウスへの外科的インプラント手法について十分に理解できるはずです。この外科的手法を習得すれば、適切に実施する場合に90分から120分で完了します。麻酔深度の指標として、動物の呼吸を常にモニタリングすることを忘れないでください。

動物の呼吸回数が4～5秒に1回未満である場合は、麻酔が深すぎる可能性があります。逆に、2秒に1回より頻繁に呼吸している場合は、麻酔が浅すぎる可能性があります。吸入麻酔薬のisof fluorineを使用する際は、適切な安全上の予防措置を講じてください。

光遺伝学的刺激に使用するレーザーから網膜を保護するため、手術室の換気を十分に行ってください。保護ゴーグルを着用するか、動物を遮光キャビネットに入れてください。乳酸バイオセンサーと光ファイバーケーブルの植え込みは、完全に覚醒したマウスで練習しておく必要があります。

マウスはこれらの手順に従わないため、固定する必要があります。ただし、動物に怪我をさせたり、呼吸を妨げたりするほど強力に拘束してはなりません。