ナチュラルキラーT細胞の細胞（AAPC）媒介活性化と増殖を提示する人工抗原

本手順の全体的な目的は、NK T細胞を増殖させるためのCD 1Dベースの人工抗原提示細胞（aAPC）を作製することです。まず、磁気ビーズを機能化するためにタンパク質を添加します。次に、末梢血から得られた初期のNK T細胞集団を濃縮します。

次に、濃縮したT細胞をA A PCと共培養します。最終ステップとして、A A PC細胞集団の表現型と機能を評価します。最終的に、フローサイトメトリー分析によって、増殖させたT細胞サブセットの純度を決定できます。樹状細胞を利用する現在の手法と比較してAPCを用いる主な利点は、樹状細胞ではドナー間の個体差が大きくなる可能性がある点です。

aAPC（人工抗原提示細胞）は、NK T細胞を増幅させるための、再現性のある既製品の標準化された手法を提供します。この手法のアイデアを最初に得たのは、私がジョンズ・ホプキンス大学でSchneck博士とOakey博士と共に研究していた時でした。彼らは、古典的なCD8 T細胞サブセットの増幅に人工抗原提示複合体を利用する分野を切り拓いた先駆者です。

本手順の実演は、博士研究員のDr.James Eastと、私の研究室のリサーチアソシエイトであるDr.Wendyの息子が行います。まず、1 mLのdyna bead M four 50 epoxy beadsを5 mLの透明ホウケイ酸ガラス製ネジ付きバイアルに移します。次に、別の1.5 mLマイクロ遠心チューブを用いて、ビーズを3 mLの滅菌ボレート緩衝液で洗浄します。

100 µgのヒトCD 1D IG二量体と、20 µgの目的の共刺激分子を、1 mLのカルシウムおよびマグネシウムフリーPBSに加えます。次に、ビーズが入ったガラスバイアルを磁石の上に置き、ホウ酸バッファーを吸引除去します。その後、タンパク質混合液をガラスバイアルに加え、キャップを閉めます。

バイアルを転倒させて直ちに溶液を混合し、キャップをパラフィルムで覆い、4 °Cのローテーターで一晩静置します。翌日、ガラスバイアルを再びマグネットの上に置き、ビーズに触れないよう注意しながらタンパク質混合物を慎重に除去します。3 mLのビーズ洗浄バッファーを加え、4 °Cのローテーターで5分間インキュベートすることを3回繰り返し、ビーズを洗浄します。

タンパク質がビーズに安定的にロードされていることを確認するために、ビーズの一部を抗体で染色し、フローサイトメトリー分析で解析します。次に、5×10⁷個のビーズを小型の1.5 mLガラスバイアルに移し、1 mLの滅菌PBSでビーズを洗浄します。その後、使用する48〜72時間前に準備してください。

ビーズに抗原をロードする間、洗浄済みビーズを1 mLの滅菌PBS中の抗原で負荷します。まず、ヘパリン処理したドナー血液を室温で同容量のPBSで希釈して、PBMCを回収します。次に、室温のPHI 15 mLを50 mLコニカルチューブに加え、希釈した血液混合液25 mLをPHIの上にゆっくりと重層します。

その後、ブレーキをオフにした状態で、室温、700 ×gで30分間サンプルを遠心分離します。パステルピペットを使用して、リンパ球の界面を慎重に新しい50 mLコニカルチューブに移します。次に、リンパ球を50 mLのPBSで洗浄し、上清を廃棄して、単一ドナーからのチューブを1本のチューブにまとめます。

PBMCをさらに20 mLのPBSで洗浄した後、細胞数をカウントし、max bufferを用いて5 × 10⁷ cells/mLの濃度で再懸濁します。T細胞画分を分離するため、EP human T-cell enrichment kitに含まれるPAN T-cell enrichment solution 100 µLを、2 mLのPBMCに加え、室温で10分間インキュベートします。その後、磁気ビーズ100 µLを加えて、さらに室温で10分間インキュベートします。

溶媒の最終量を2.5 millilitersにし、チューブを磁石に配置します。5分後、CD3陽性分画を速やかに15 milliliterのコニカルチューブに注ぎ出します。次に、5 millilitersの冷えたmax bufferで細胞を洗浄し、生存細胞数をカウントします。

まずCD 1 61陽性細胞を選択するため、染色用に分注量を取り出します。濃縮したT細胞を980 µLの氷冷max bufferに再懸濁し、10 µgのanti CD 1 61モノクローナル抗体とともに4 °Cで10分間インキュベートします。細胞を洗浄した後、ペレットを800 µLのmax bufferおよび200 µLのanti-US IgG one microbeadsで再構成します。

この溶液を4 °Cでさらに10分間インキュベートします。細胞をマイクロビーズとともにインキュベートしている間に、3 mLのmax bufferを加え、LSカラムを平衡化します。この細胞分画を洗浄した後、3 mLのmax bufferに懸濁した細胞をゆっくりとカラムにピペットで加えます。

次に、カラムを3 mLの新鮮なmax bufferで3回洗浄します。その後、さらに3 mLの新鮮なmax bufferをカラムに加え、カラムを15 mLコニカルチューブに移します。精製されたCD161陽性CD3陽性細胞を押し出し、NKT細胞濃縮分画をカウントします。

濃縮したCD161陽性CD3陽性T細胞 10⁶個とaAPC 10⁶個を、16 mLの完全培地プレートで共培養して、このステップを開始します。共培養液を、低蒸発蓋付きの組織培養処理済みポリスチレンU底96ウェルプレートに、1ウェルあたり160 µLずつ分注します。12〜14日目に細胞を回収し、細胞数をカウントします。フローサイトメトリー分析により細胞集団を解析し、その後、再プレート化して共培養します。

先に示した通り、拡大培養したNKT細胞のうち、2回目の拡大後に追加で得られたNKT細胞を凍結保存します。aAPC細胞の機能を試験するため、まず、完全培地を用いて最終容量200 µLの96ウェルU底プレートにおいて、1ウェルあたり5×10⁴個のNKT細胞と5×10⁵個のaAPCを共培養します。24〜48時間後、ELISAによる分析のために細胞培養上清を回収します。この最初の図は、ここで示されているように、CD1D-Igタンパク質が磁気ビーズの表面に安定して固定化されていることを示しています。

このグラフに示されているように、CD1D IGおよび抗CD28抗体の両方が磁性ビーズの表面に発現しています。Vα14陽性のマウスNKT細胞ハイブリドーマDN30 2D3を、$\alpha$-ガラクトース抗原をロードしていないAAPCまたは$\alpha$-ガラクトースをロードしたAAPCのいずれかと共培養しました。その後、培養上清を回収し、ELISA法でIL-2産生量を測定しました。これにより、各バッチの抗原提示細胞をテストするための簡便な方法が提供されます。本実験では、ヒトCD161陽性CD3陽性の末梢血T細胞を磁性ビーズ分離法により濃縮しました。

その後、細胞をα-GalCerをロードした APC で14日間、週に1回刺激し、Vα24およびVβ11の発現を分析した。重要な点として、初期のNKT細胞集団が0.03%という比較的低濃度であっても、Vα24陽性かつVβ11陽性の集団を約67%まで増殖させることができた。ここでは、C1R CD1d細胞を、α-GalCer抗原の存在下または不在下で、指示された比率でNKT細胞と共に96ウェルU底プレートにて20〜24時間インキュベートした。

NKT細胞によるB細胞リンパ腫細胞株の細胞溶解を、クロム放出法により評価しました。PCで拡大培養したNKT細胞は、このリンパ腫細胞株を溶解させることができました。α-ガラクトシルセラミド（alpha galera）の存在下または不在下において、健康なボランティアおよびがん患者の両者のPBMCからNKT細胞を拡大培養し、α-ガラクトシルセラミドを負荷しました。

A PCを用いて、両グループからNKT細胞集団を拡大することができました。200万個のCD161陽性CD3陽性T細胞を初期集団として用いた場合、2回の拡大サイクル後に10⁷個以上の細胞を得ることができます。拡大したNKT細胞は、本研究で示したように、機能解析に使用することが可能です。

ex vivoで増幅させたNKT細胞は、Alpha GAL刺激に対して反応性を維持しており、IL 17 A、TNF alpha、およびinterferon gammaを強力に産生します。なお、初期のT細胞濃縮集団が少なく、2回目のCD 1 61濃縮ステップが実施できない場合、A A PC介在性の増幅で期待される結果が得られない可能性があることに留意してください。しかし、循環NKT細胞の割合が0.1%以上であれば、invariant NKT細胞を十分に増幅させることが可能です。

総合的に見て、これらのデータは、CD1DベースのAPCを用いて一次ヒトNKT細胞を効果的に増幅および刺激できることを示しています。この手順の後、NKT細胞の活性化のキネティクスなど、追加的な疑問を解消するためにqPCRなどの他の手法を実施することが可能です。本手法は、肝臓疾患研究に携わる研究者が、脂肪肝疾患におけるNKT細胞の役割を探索するための道を開くものです。