で食欲連想嗅覚学習

本手順の目的は、高次脳機能を分析することです。単純なモデルとして、食欲を用いたDFA幼虫の連合嗅覚学習を分析します。まず、餌入りのバイアルから、摂食中の3齢幼虫を30匹収集することでこれを実施します。

次に、報酬としてフルクトースを、嗅覚刺激として各側に1-octanolを含む臭気容器を配置したペトリ皿上で、幼虫を5分間学習させます。その後、報酬のフルクトースをなくし、各側の臭気容器に酢酸アマミールを入れた状態で、5分間の第2学習フェーズを行います。これら2つの学習フェーズを3回繰り返した後、報酬なしの状態で、対向する側に臭気容器を配置し、5分間のテストに幼虫をさらします。

最終的に、あるオクタルに対する酢酸アマールの相対的な臭好性は、ショウジョウバエの幼虫が嗅覚刺激と糖報酬の間の連合を形成できることを示しており、これは遺伝的な操作が容易なシステムにおいて連合学習を研究するために利用可能です。この手法を神経機能の遺伝的干渉と組み合わせることで、「報酬を信号として伝えるニューロンはどれか」、あるいは「反復的な記憶の獲得または想起に必要十分なニューロンはどれか」といった、学習と記憶の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手順を実証することは、術後の評価に寄与します。

私の研究室の博士課程の学生が、まずフルクトースを含まない2.5%arosペトリ皿を作成します。フルクトース入りプレートを調製するには、溶解したarosにフルクトースを添加し、プレートに分注します。次に、実験者が識別できないように、これらの各プレートに異なる記号を書き込んでラベル付けします。

フルクトースを含むディッシュを条件付け報酬とし、何も入っていないディッシュを非報酬とします。条件刺激として、10 µLの純粋な1-オクタノールを入れたカスタムメイドのテフロン製臭気容器を計3個準備します。蓋には、臭気を揮発させるための小さな穴が開いています。

次に、パラフィンオイルで1:50に希釈した酢酸アミルを10 µL入れた臭気容器をさらに3つ用意します。この希釈液は、純粋な1-octanolを10 µL用いた場合と同等の誘引性を持ち、遊走せず摂食している個体を30匹集めることで開始します。第三に、餌 vial から取り出します。

このプロトコールは、一日のどの時間帯でも実施可能です。概日リズムには依存しません。larvaを水道水が数滴入ったペトリ皿に移し、筆を使って慎重に前後に動かします。

次に、数滴の水道水を入れた2枚目のペトリ皿に幼虫を移します。幼虫の体壁に餌ペーストが付着していないか確認してください。その後、ペトリ皿を実験装置にセットし、特定の糖の合図と臭いを関連付けるよう幼虫を訓練します。

使用する2種類の刺激用ディッシュのうち、いずれか1つのディッシュの左側と右側に、におい容器を配置します。ここでは8方向の例を示していますが、実験者は報酬の内容を把握していないため、選択は任意です。次に、幼虫のグループをディッシュの中央に配置します。

蓋を閉め、動物を刺激にさらしながら5分間待機します。幼虫が水滴の表面張力に抗して、閉じ込められることなく自由に探索できるようにしてください。新しいAmal acetateの容器を新しいシャーレの上に置きます。

5分後、湿らせた筆を使用して、左右に反対の刺激が配置された反対のタイプのシャーレに幼虫を移します。ここでの臭気は酢酸アミルです。幼虫を移した後、蓋を閉め、動物を5分間探索させます。

この時間が経過した時点で、第1ラウンドのトレーニングが完了します。第1ラウンドと同様の手順で、さらに2ラウンドのトレーニングを実施します。動物を湿らせたブラシで誘導し、各刺激と報酬の組み合わせに合計3回ずつさらします。

実験テスト場所として、各刺激の新鮮な臭気容器を、コーティングされていないアガーのみのペトリ皿の反対側に1つずつ配置します。訓練した動物を皿の中央に移動させます。蓋を閉め、5分間待ちます。

5分後、ディッシュの下に、左、右、中央の3つのゾーンを明確に定義するテンプレートを敷き、各ゾーンの幼虫の数を数えます。中央ゾーンは「非好みのスコア」として扱い、これにより解析の制約を高め、バイアスを軽減させます。最後に、実験を完了させるため、新たに30匹の3齢期の餌付けされた幼虫を選び、報酬と刺激の組み合わせを反転させてトレーニングとテストを繰り返します。

引き続き同じ匂い容器を使用します。形質転換動物が報酬刺激に対して正常な匂い処理能力を持っているかを確認するため、いくつかの対照試験が必要です。未経験の匂いに対する好みの試験は、トレーニングおよびテスト時と同様に、30匹の幼虫を回収して洗浄することから始めます。

次に、一方の側に刺激バイアルを1つだけ配置したアガロースシャーレに幼虫を載せます。蓋を閉め、5分間待ちます。その後、テンプレートを用いて、刺激に対するシャーレ内の近接側、中央、および遠位側にいる幼虫の数をカウントします。

ナイーブな糖嗜好性を検証するため、実験で使用する各刺激についてこのテストを行います。シャーレの半分を切り取り、空いたスペースに別の種類の溶融アガロースを満たすことで、ハーフ＆ハーフのペトリ皿を準備します。両側の体積が一致するように注意し、明確な境界線が形成されないようにしてください。

この操作には、室温で準備し、給餌後30分が経過して洗浄済みのハーフディッシュを用いて練習が必要な場合があります。3匹のスターラーバをディッシュの中央に配置します。蓋を閉め、5分間待ちます。

続いて、テンプレートを用いて、両側および中央にある幼虫の数を数えます。この手順を用いて、trenchgenic幼虫のトレーニングとテストを行いました。例示した刺激を用い、ペトリ皿の異なる領域に存在する幼虫の数をデータとして集計しました。

このデータ嗜好から5分後に指数を算出し、相互にトレーニングした群からパフォーマンス指数を導き出した。テストした幼虫はトランスジェニックであったため、臭気容器（充填済み）と空気の選択肢に加え、純粋な香気と香気＋糖の選択肢も提示した。算出した指数を箱ひげ図で検討した結果、動物はフルクトース香気を報酬として、1-オクテン-3-オールと酢酸メチルの区別を学習できることが明らかになった。

動物は両方の刺激を誘引剤として認識し、エアロよりもフルクトースエアロを好むという素朴な嗜好性を示しました。この実験パラダイムは、多種多様な嗅覚・視覚刺激、および多種多様な報酬・罰刺激を用いて成功を収めてきました。このパラダイムをショウジョウバエで利用可能な多くの強力な遺伝学的操作と組み合わせることで、神経ネットワークの解析に特に有用となります。例えば、gal4発現パターンによって定義される特定のニューロン群を遺伝学的に操作することで、食欲学習におけるそれらニューロンの機能的な役割を評価することが可能です。

この手順を、ニューロン機能の遺伝学的干渉と併せて用いることで、学習と記憶に関与する幼虫脳の神経ネットワークを解析することができます。幼虫の脳は構造が単純であるため、単一細胞レベルでの解析が可能です。