準備とINTERCEPT血液系を使用してDouble線量バフィーコート血小板製剤の病原体不活化

このビデオでは、7つのバフィーコートのプールから2回分量（ダブルドーズ）の血小板濃縮液を調製し、その後、Interceptを用いて処理します。このビデオを視聴することで、病原体不活化済みの2回分量血小板濃縮液の製造方法について十分に理解することができます。まず、概略図による概要を説明し、続いて実演を行います。

寄贈された全血の最初の7ユニットを遠心分離および分画し、容量とヘマトクリット値の目標を満たす7ユニットのバフィーコートを得ます。これらのバフィーコートを接続してプールし、遠心分離します。その後、血小板懸濁液を残留赤血球から分離し、病原体および白血球を不活化するための2倍量血小板濃縮液を作製します。

2回分量の血小板濃縮液を、核酸を架橋させるInterceptシステムを用いて処理します。最終的に、この手順により、pH、グルコース、乳酸、PO₂、PCO₂、および血小板数による評価で、7日間の保存期間にわたり許容可能なin vitro品質を持つ2回分の治療用血小板用量が得られます。血液センターの技術者が手順を実演し、処理要件について説明します。

まず、2回分量の血小板濃厚液が、300から420 mLのインターセプト処理基準を満たしていることを確認してください。血小板量は2.5から7×10¹¹で、赤血球数は4×10⁶/mL未満である必要があります。本手順は、450 mLのトップボトム採取セットで回収された全血7ユニットを用いて開始します。

血液製剤を遠心管に入れ、製造元の指示に従い、室温にて4,880 RCFで11分間、ブレーキ設定B5でハードスピン（強遠心）を行います。遠心後、血液は赤血球、バフィーコート、血漿の3層に分離します。血漿を上部のサテライトバッグに、赤血球を下部のサテライトバッグに分注し、約48 mLのバフィーコートと37%のヘマトクリットを回収容器に残します。

バフィーコートを血小板振盪機に設置し、室温で一晩置きます。7つのバフィーコートと300 mLのSSPおよび血小板添加液を、滅菌接続してください。添加液を最上部にした縦列構成で、ここに示すように、添加液と最初のバフィーコートの間のラインをクランプします。バフィーコートユニット間の溶接箇所を開き、最後のバフィーコート容器に液が流れ込むようにします。

次に、添加液と最初のバフィーコート間のクランプと溶接部を開き、クランプを閉じる前に、各バフィーコート容器に順次、添加液の約3分の1（約100 milliliters）を流して洗浄します。この洗浄工程をさらに2回繰り返し、毎回約100 millilitersの添加液を使用します。回収したバフィーコート容器を空の容器から切り離します。添加液を含むバフィーコート回収液の総量は、約600 millilitersになります。

プールしたバフィーコートを振盪機にかけ、室温で1時間放置します。次に、leco白血球除去フィルター一体型の血小板保存容器を、バフィーコートプールが入ったバッグに接続します。プールしたバフィーコートと血小板保存容器を遠心分離機にかけ、462 RCFで9分20秒間遠心分離します。

遠心分離後、血小板懸濁液をLuca還元フィルターを通して血小板保存容器に分注します。これにより、420 mL中に約7×10¹¹個の血小板を含むダブルドース血小板濃縮液が得られ、これをInterceptを用いて病原体不活化処理することが可能です。ダブルドース血小板濃縮液は、アントイン容器、照射容器、および2つの保存容器で構成されるIntercept処理セットを用いて処理されます。

血小板懸濁液の容器をインターセプト処理セットのAmin容器に接続します。次に、血小板を吊り下げます。Amin容器の底部にあるカニュラを切り離し、溶液が照明容器に流れ込むようにします。

次に、Amin容器の上のカニューレを折って、血小板がAmin容器を通り、照射容器へと流れるようにします。血小板とアミトシン（am tosin）の混合液を静かに混ぜ合わせます。照射容器を軽く押し、容器内の空気を追い出します。

照射容器とアマト容器の間のチューブを密封し、照射容器から伸びるチューブが 4 cm 以下になるようにします。空の容器を取り除いて廃棄します。プロセッシングセットをイルミネーターに設置し、左側の大きなコンパートメントに照射容器を、右側の小さなコンパートメントにオーガナイザーを配置します。

ドネーションIDをスキャンします。製品コードと処理を確認してください。ロット番号をイルミネーターに設定します。

金属製のカバーとドロワーを閉じます。スタートボタンを押し、照射を開始します。イルミネーターにより、照射容器内の血小板アミン混合物に対して制御された用量のUVA光が照射されます。

アミンは、血小板ユニット内に存在する可能性のある病原体の核酸塩基対の間にドッキングします。光照射により、永続的な架橋が形成されてDNAまたはRNAが結合し、病原体が複製できなくなるため、血液製剤の投与を受けたレシピエントへの疾患誘発を防ぐことができます。光照射後、処理セットを取り除いてください。

次に、オーガナイザーからコンテナを取り出し、血小板および処理セットを吊り下げます。照明コンテナの出口にあるカニュラを切り離し、血小板をCADコンテナに流入させます。CADコンテナ内部には、血液製剤中の残留アミンレベルを低減させるために固定化されたマクロポーラスポリスチレンビーズを備えたウェハーが入っています。

CADウェハーを曲げないように注意しながら、CAD容器内の空気を照明容器へと排出します。CAD容器の入口ポート付近のチューブを密封します。

空の照明用コンテナを取り除き、廃棄します。ストレージコンテナを装着したCADコンテナを血小板撹拌機に6時間から16時間設置します。これにより、残留アムリンの濃度が2 µM以下に減少します。

CAD処理後、血小板ユニットをアジテーターから取り出して吊り下げ、CADコンテナーの出口にあるカニューレを折って、血小板を2つの保存容器に流し込みます。次に、保存容器から空気を排出します。Y字フィッティングより上のチューブを密封し、CADコンテナーを取り外します。

その結果、in vitroでの血小板機能を評価するための、病原体を不活化した2つの血小板濃厚液が得られました。血小板数、pH、pO₂、PC O₂、乳酸産生量、およびグルコース消費量を測定しました。血小板濃厚液は保存7日目まで測定されました。

この図は、インターセプト処理前の2倍量血小板濃縮液の平均開始血小板数と、保存7日目までの処理済み分割製品それぞれの平均血小板数を示しています。ここでわかるように、保存中の血小板減少は約9%でした。この減少は、従来の血小板の保存中に予想される血小板減少と差はありません。欧州の要件に従い、血小板のpHは有効期限終了まで6.4以上に維持される必要があります。

処理中、血小板濃縮液のpHは、血小板濃縮液の量および血小板保存容器のガス透過性に基づき、わずかに低下します。この図は、分割血小板製剤を7日間保存した際のpHの変化を示しており、保存期間中、pHは安定し、処理要件の範囲内で適切に維持されています。保存された血小板内では好気性代謝が継続して行われているはずであり、これは患者への輸血後に血小板が生体内で機能できる能力の指標となります。

血小板のO2消費量およびCO2産生量は、PL 24 10容器に保存されたインターセプト血小板が7日間の保存期間中、呼吸を継続していることを示しています。同様に、保存血小板においても嫌気性代謝が継続すると考えられます。したがって、グルコース消費量と乳酸産生量も、輸血後の血小板の機能能を示す指標となります。

これら2つの図は、7日間の保存期間における乳酸およびグルコースのレベルを示しています。血小板のグルコース消費量と乳酸産生量は、互いに一致しています。7日間の保存期間中、5つのユニットでグルコースレベルが1.11 millimoles per liter未満となり、これはグルコースアッセイの下限値に相当します。

バフィーコートの調製およびプーリングのバリデーションにより、インターセプト処理の入力基準、具体的には容量、血小板数、血漿比、および赤血球混入率を満たす血小板濃厚液が作製されました。最終的な製剤は、血小板投与量およびpHを含め、7日間の保存期間にわたってバリデーション基準を満たしています。単回投与分の血小板濃厚液を作製する従来のバフィーコート調製法に対する本手法の主な利点は、採血からの成分回収率を最大化し、2回投与分（ダブルドーズ）の手法を用いることで運用コストを削減し、さらに輸血伝播性病原体を不活化させることで患者の安全性を向上させることができる点にあります。