遺伝子発現とE4orf4誘発細胞死にノックダウン効果の測定のための条件付きノックダウン細胞株の作製

本実験の全体的な目的は、ACF1またはSNF2Hのノックダウンが、E4または4によって誘導される細胞死に及ぼす影響を観察することです。これは、ドキシサイクリンの添加によってACF1またはSNF2Hのsrna発現を条件付きで活性化させ、その第2段階としてACF1またはSNF2Hタンパク質レベルを減少させた細胞株を構築することで達成されます。得られた細胞株の細胞を、ACF1またはSNF2Hの発現を減少させるためにドキシサイクリンで処理するか、あるいは未処理のままにします。

次に、S-H-R-N-A耐性ACF1またはSNF2Hが存在する場合としない場合で、E4orf4を細胞に発現させます。ACF1またはSNF2HがE4orf4誘発性の細胞死に及ぼす影響を調べるため、JYアッセイを用いてアポトーシス形態を示す核をカウントし、ACF1またはSNF2HのレベルがE4orf4の毒性に与える影響に関する結果を得ます。RNAの一時的トランスフェクションなどの他の手法と比較した本手法の主な利点は、すべての細胞でS-H-R-N-Aが発現し、従来のプラスミドと共発現する細胞の割合が高くなることです。この方法は、E4orf4誘発性細胞死の根底にあるメカニズムへの洞察を提供しますが、他のプロテインタンパク質の研究にも適用可能です。

Ana Lafeに加えて、私の研究室の研究者が本手順の一部を実演します。誘導性細胞株の作製手順を開始するには、T-Rex 2 9 3細胞を、テトラサイクリンを含まず5 µg/mLのblasticidinを含む血清添加DMEM 8 mLを用いて、10 cmプレートあたり約5×10⁶個の密度で播種します。プレートを37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートしてください。翌日、トランスフェクションの前に、培地を8 mLの新鮮な培地で交換します。トランスフェクションに使用するプラスミドは、テトラサイクリン誘導性H1プロモーターによって駆動されるACF1またはSNF2 H-S-H-R-N-AをエンコードするP superior neo plus GFPプラスミドであり、構成的PGKプロモーターによって駆動されGFPに融合したネオマイシン耐性遺伝子も含んでいます。

10 µgのプラスミドDNAを500 µLの150 mM塩化ナトリウムに加え、ボルテックスで撹拌する。次に、別のチューブに500 µLの150 mM塩化ナトリウムを入れ、DNA 1 µgあたり2 µLのjet PY試薬を加えてボルテックスで撹拌する。このjet pie溶液をDNA溶液に加え、ボルテックスで十分に混合する。

室温で15分間インキュベートします。15分後、70〜80%コンフルエンスに達した10 cmプレートに、DNA複合体をピペッティングで静かに滴下します。翌日にT-Rex 2 9 3細胞を混合します。

培地を、以前と同様に、500 µg/mLのG418を含む選択培地（本例ではDMEM）に交換します。その後2週間、細胞を観察してください。コロニーが出現するまで、3〜4日ごとに選択培地を同等の新鮮な培地に交換します。

コロニーを目視で確認し、プレートの底面にカラーマーカーで位置をマークします。顕微鏡下で、コロニーが十分に分離していることを確認してください。コロニーが顕微鏡なしで視認できる大きさまで成長したら、分離が可能です。

本手順を成功させるには、コロニー分離の際に十分に離れたコロニーを選択することが重要です。無菌フード内で、プレートから培地を吸引します。PBSで軽く洗浄し、残った液体をすべて十分に吸引してください。

プレート上の1つのコロニーに0.25% trypsin-EDTAを3 µL加え、細胞がプレートから剥離するまでピペッティングを繰り返します。剥離した細胞を24ウェルプレートのウェル内の選択培地に移します。プレート上の他の複数のコロニーについても同様に操作を繰り返します。

細胞を37 °C、5% CO2条件下で、ウェルがいっぱいになるまで培養します。その後、各元のコロニーから細胞を分取し、別の12ウェルプレートの3つのウェルにそれぞれ分配して、翌日まで一晩インキュベートします。1枚のプレートの培地を、二回蒸留水で調製したストック溶液を用いて 1 µg/mL のドキシサイクリンを含む培地に交換します。

コントロールプレートの培地を、ドキシサイクリンを含まない培地で交換します。細胞を37°C、5% carbon dioxideで72時間インキュベートします。その後、処理済みウェル1つと未処理ウェル1つから細胞を回収し、ウェスタンブロット解析を行い、ACF1またはSNF2Hのノックダウン効率を判定します。代表的な結果をここに示します。

このブロットは、SNF2Hおよびα-tubulinに対する抗体で染色されました。後者は、2つのクローンのローディングコントロールとして使用しています。クローン4および5は、ドキシサイクリン誘導によってSNF2Hが著しく減少したため、次節で説明するノックダウン実験に使用することに決定しました。

3枚目のプレートの未処理細胞は、選択した細胞株の拡大に使用し、その後、それらの細胞を分注して凍結保存します。10 cmプレートの選択培地でACF1またはSNF2Hプレート細胞のノックダウンをさらに誘導するために、半数のプレートに1 µg/mLのドキシサイクリンを添加し、37 °C、5% CO2で48～72時間インキュベートします。各プレート群は、各ポイントにつきDPIアッセイ用の重複分2枚を含む12枚の6 cmプレート分、および各サンプルのウェスタンブロット解析用プレート1枚分の細胞を供給する必要があります。

誘導から48〜72時間後、各群の細胞をトリプシンで剥離し、細胞数を算出した後、ドキシサイクリンを含むまたは含まない同一の培地を用いて、6 cmプレートあたり1.5×10⁶個の細胞を播種します。細胞を37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートし、翌日に指示通りに細胞をトランスフェクションします。

未処理およびドキシサイクリン処理済みの細胞のいずれに対しても、以下の4通りの方法で3連でトランスフェクションを行います。1つ目は空プラズミドとGFP発現プラズミド、2つ目は空プラズミドおよびSHRA耐性ACF1-GFPまたはSNF2H-GFPを発現するベクター、3つ目はE4をコードするプラズミド、4つ目はGFP発現プラズミド、E4をコードするプラズミド、およびSHRA耐性ACF1-GFPまたはSNF2H-GFPを発現するベクターのすべてを用います。トランスフェクション後、すべてのプレートを37°C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。

細胞へのトランスフェクションの翌日に、ウェスタンブロット解析用にサンプルあたり1プレートからタンパク質を抽出し、ACF1またはSNF2Hが効率的にノックダウンされていること、およびE4またはF4が各サンプルで均等に発現していることを確認します。残りの16プレートはDPIアッセイに使用します。DPIアッセイに使用するプレートから培地を吸引し、化学薬品用フード内でPBSを用いて細胞を穏やかに洗浄します。

PBSで調製した4%パラホルムアルデヒド1 mLを加え、細胞を覆うようにして室温で15分間、振盪せずにインキュベートします。パラホルムアルデヒドを吸引し、室温で5分間振盪しながらPBSで洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返し、計3回の洗浄を行います。3回目のPBS洗浄後、-20°Cで保存した80%エタノールを加え、-20°Cで少なくとも1時間インキュベートします。

エタノールを吸引し、室温で5分間ずつ振盪しながらPBSで細胞を2回洗浄します。その後、非特異的な抗体結合を防ぐため、同様に振盪しながら、0.5% BSAおよび0.05% Tween 20を含むPBS（PBSBT）で室温で5分間1回洗浄します。10%ヤギ血清を含むPBSBTバッファー1 mL中で、室温で振盪しながら20分間細胞をブロッキングします。

次に、細胞をP-B-S-B-Tで2回、各5分間洗浄します。一次抗体（本例ではE4または4特異的抗体）を含む1 mLのP-B-S-B-Tを用いて、室温で振盪しながら1時間、細胞をインキュベートします。その後、P-B-S-B-Tで2回、次いで0.1% BSA含有PBSで1回、それぞれ5分間洗浄します。

次に、適切な蛍光標識二次抗体および0.5 µg/mLの最終濃度のDPIを含むPBS 0.1%BSAを1 mL、細胞に添加します。室温・暗所にて振盪しながら40分間インキュベートします。最後に、PBSで5分間洗浄します。

アスピレーションでウェルを乾燥させ、プレートを逆さまにした状態でさらに1時間から一晩保持して完全に乾燥させ、アルミホイルで覆います。Flora Mount G溶液を用いて細胞上にカバーガラスを載せます。カウントの準備が整うまで、プレートを4°Cの暗所で保存します。プロトコルに記載されたさまざまな処理を行ったアポトーシス核細胞を固定し、形質転換細胞の核を可視化するために、E4または4特異的抗体およびDPIで染色しました。

この図は、E4orf4およびGFPを発現している細胞の例を示している。パネルAはコントロールであるGFP単独のタンパク質発現を示し、パネルBはE4orf4の発現を示している。パネルCにはDAPIで染色された核が示されており、パネルDにはマージ画像が示されている。白い矢印は、アポトーシス形態の核を持つ、GFPおよびE4orf4を導入した細胞を示している。赤い矢印は、不規則な形状を持つがアポトーシス核としてはカウントされない核を示しており、アスタリスクは有糸分裂中の核または分裂直後の核を示している。試験の客観性を最適に維持するため、DAPI染色によって可視化された凝縮または断片化した核の数をカウントし、導入細胞集団におけるアポトーシス形態を示す核の割合を算出した。

各種サンプルにおけるアポトーシス核の計数は、計数者がサンプルの正体を知らされないブラインド法で実施されました。代表的な結果をこのグラフに示します。E4orf4発現細胞では核異常の割合が高く、E4orf4が細胞死を誘導することが確認されました。核異常の割合が最も高かったのは、shRNA介在性ノックダウンによってACF1レベルが低下したE4orf4発現細胞であり、ACF1のノックダウンがE4orf4による細胞死を増強し、細胞におけるE4orf4の毒性を高めることが示されました。

ウェスタンブロットで観察されたように、ACF oneの低レベル発現は、E fourまたはfourレベルの増加によるものではありませんでした。この手順を行う際は、DPIを用いてアポトーシス核の正確な計数を容易にし、これらの核の同定に厳格な基準を適用することが重要です。この手順に加えて、本手順後のDA pseの結果を検証するために、コロニー形成アッセイなどの他の手法を実施することも可能です。

さらなる疑問を解消するために、共免疫沈降法などの他の手法を実施することができます。例えば、調査対象のタンパク質間に物理的な相互作用が存在するかどうかを確認する場合などが挙げられます。