蛍光パターンを調査するための凍結セクショニング酵母コミュニティ

次の実験の全体的な目標は、酵母群集の断面を作成し、群集内のさまざまな蛍光細胞集団の空間分布を調べることです。これは、最初にコミュニティを凍結し、次にメタノールを使用してコミュニティ内の細胞の空間分布を維持するために固定することによって達成されます。第2のステップとして、メタノールを蒸発させて、包埋OCT化合物の浸透を可能にする。

その後、埋め込まれたコミュニティは凍結切片の準備として凍結されます。次に、クライオオメのセクションです。コミュニティと断面は蛍光顕微鏡で画像化できますコミュニティ内の蛍光細胞集団の空間分布を示す結果が得られます。

光学セクショニングなどの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、これらのコミュニティの奥深くにある集団の空間分布を明らかにすることです。この手順を開始するには、メンブレンフィルターで酵母群集を成長させます。このプロトコルは、マイナス20°Cの冷凍庫で次に直径6ミリメートルのメンブレンフィルター上の8つの細胞の2×10未満の典型的なコミュニティに対応します。

蛍光をより多く保持するには、直径1センチメートルの底を覆うためにワットマン5 4 1濾紙を使用します。さて、この濾紙は、コミュニティを移動させるためのキャリアとして使用されます後の段階で、マイナス20°C、100%メタノールの1ミリリットルをウェルに追加し、温度が平衡化するためにウェルをマイナス20°Cに保ちます。次に、ピンセットを使用して、メンブレンフィルターをコミュニティと一緒に液体窒素に少なくとも15秒間浸すことにより、酵母コミュニティを凍結します。

次に、凍結したコミュニティをマイナス20°Cの井戸に移します。冷凍庫内のメタノールは、コミュニティが水平に保たれるようにします。メタノールに浸すと、20分間待つと、メンブレンフィルターがメタノール中で崩壊し始めます。

20分後、メタノールウェルのキャリアワトマン濾紙を使用して、摂氏マイナス20度に保たれた冷たいシャーレにコミュニティを移します。転送するときは、コミュニティをキャリアのワトマンフィルターの上に置きます。冷たいペトリ皿に入れる前に、別の厚いワットマンペーパーを使用して余分なメタノールを引き出します。

これにより、メタノールの蒸発時間がサンプルごとに一貫していることが保証されます。メタノールが蒸発するまで4〜6時間待ちます。適切なタイミングで蒸発を終わらせることは、この手順を成功させるために重要です。

サンプルの過剰乾燥を避けるために、メタノールが蒸発している間、蒸発中に酵母群集の状態を定期的に確認してください。サンプルが各辺から少なくとも約2ミリメートルのマージンを持つように十分に大きい長方形の立方体のアルミホイル容器を作成します。この容器の底にOCTを一滴垂らして、サンプルが四方からOCTで囲まれるようにします。

蒸発が完了したら、マイナス20°Cの冷凍庫からサンプルを取り出します。濾紙の酵母菌群集で覆われていない部分を切り取ります。この手順は迅速に実行することが重要です。

サンプルの乾燥しすぎを防ぐため。アルミホイル容器の底面にコミュニティを置き、すぐにサンプルをOCTでコミュニティの高さから3〜4ミリメートル上に覆います。10 分待ちます。

最後に、OCTに埋め込まれたサンプルをドライアイス上の金属プレートに置き、凍結したコミュニティを摂氏マイナス20度または摂氏マイナス80度で凍結保存します。凍結したコミュニティの切片化に備えて、クライオ切片チャンバーの温度を摂氏マイナス25度に設定します。サンプルの温度がチャンバーの温度に達するまで、サンプルをチャンバー内に置いておきます。

次に、サンプルからホイルを取り除き、余分なOCTを切り取ります。クライオマウントにOCTを一滴垂らし、サンプルをクライオマウントにマウントします。OCTの厚さが2〜3ミリメートルになるように、露出したワットマン濾紙でサンプルの側面にOCTを均一に広げます。

サンプルのすべての側面で2〜3ミリメートルのOCTマージンを確保することで、切片の完全性を維持するのに役立ちます。切片化する前に、OCTをクライオスタットチャンバー内で凍結させます。OCTサンプルブロックの側面を使用して、ブレードに対してサンプルを位置合わせします。

サンプルがブレードに対して位置合わせされていない場合、切片化はサンプルの角または側面から開始されます。マウントを調整して、ブレードがサンプルブロックの完全に垂直な面を切断するようにします。酵母群集の典型的な切片は、厚さが約14マイクロメートルです。

切片を切断した後、室温に保たれた顕微鏡スライドを使用して切片を採取します。スライドをゆっくりと切断部に移動すると、切片が溶けて顕微鏡に移ります。1枚のスライドに最大18セクションまで転写できます。

スライドは低温、できればマイナス20°Cで保存してからイメージングしてください。シグナルの損失は、4°Cで1週間保持すると、蛍光シグナルが最大になります。イメージングは切片化後すぐに行う必要があります。

同じ条件下で増殖した酵母群集の垂直断面の代表的な蛍光画像をここに示します。このコミュニティは、蛍光タンパク質でタグ付けされた2つの光向性ビジエ株で構成されています。赤で視覚化されたMチェリーと緑の競争として視覚化されたY-E-G-F-Pは、スペースを含む共有リソースの競争として視覚化され、垂直断面に表示されるように柱状のパターンにつながります。

1つのセルまでの分解能は、断面で解決できます。この図は、底面パネルにメタノール固定法を適用した場合と、上面パネルにメタノール固定しない場合で得られた断面を比較したものです。蛍光シグナルは固定されずにコミュニティセクションに保存されますが、コミュニティの完全性が損なわれます。

その結果、一部の細胞はセクションの端の周りで浮遊し、固定コミュニティと比較して全体的な収量が低くなります。メタノール固定はコミュニティ細胞を一緒に保ちますが、コミュニティの高さの減少で観察されるように収縮を引き起こします。この図は、DS REDおよびYFP蛍光タンパク質でティードされた2つのProtopic株からなる酵母群集の代表的な明視野および蛍光垂直断面を示しています。

コミュニティの上にある細胞は、母細胞とは異なるように見えるクラウンを形成し、明視野での散乱が強く、蛍光が明るいことを特徴としています。これらのパターンは、酵母コロニーで報告されている分化パターンと一致しています。このビデオを見た後、酵母群集内の蛍光su空間パターンを調べるために凍結切片を使用する方法をよく理解しているはずです。