フローサイトメトリーによるヒト好中球の核因子の活性を検出するために簡単で効率的な方法

この実験では、フローサイトメトリーを使用して、好中球から単離された免疫標識核の核タンパク質を検出および定量し、ヒト末梢血から好中球を精製します。デキストリンで赤血球を除去し、続いて血漿の密度勾配遠心分離を行います。次に、抗受容体抗体を使用して、インテグリンまたはFC受容体を介して精製された好中球を刺激します。

核を単離し、目的のNU核因子に対する特異的抗体で免疫標識するためにサンプルを固定します。例えば、NF κBは、核因子の活性化の小さな変化を検出するために、最終的にフローサイトメトリーで核を解析します。その結果、好中球のインテグリンを介した刺激が、kappa Bの転写因子Nの核濃度の増加につながることを示す結果が得られています。核因子の活性化につながるシグナル伝達経路は、通常、レポーター遺伝子アッセイまたは初代細胞の電気泳動移動度シフトアッセイによって研究されます。

多くの場合、これらの方法は適していません。フローサイトメトリーは、単離された核内の核タンパク質の迅速な検出と定量を可能にします。健康な成人ボランティアから採取したばかりの血液10ミリリットルから始めます。

6%デキストリンT 500溶液の2ミリリットルを15ミリリットルの円錐形遠心分離管にピペットで移します。次に、チューブを2〜3回反転させて混合した10ミリリットルの血液を加え、新鮮な15ミリリットルの円錐形遠心分離チューブで重力による赤血球沈降を45分間待ちます。5ミリリットルのFIフィアルパックを置きます。

堆積した赤血球の上に形成された白血球に富む血漿を採取します。フィアルパックの上に慎重に重ねて2つの相を形成し、摂氏4度で516Gで20分間遠心分離します。上清を取り除き、チューブをラックに軽くたたいて細胞ペレットを壊します。

次に、細胞を10ミリリットルの冷たいPBSに再懸濁します。細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐形遠心チューブに移し、摂氏4度で290Gで5分間遠心分離します。前と同じように細胞ペレットを破砕し、灰汁赤血球に10ミリリットルの冷たい低張溶液を加えます。

チューブを静かに回してちょうど1分間混ぜます。次に、10ミリリットルの冷たい高張溶液の混合物を加え、氷上に保存します。次に、遠心分離によって好中球をペレット化した後、細胞を列挙します。

PMNを10〜7セル/ミリリットルで一時停止します。冷たいPBSでは、細胞を氷の上に保ちます。100マイクロリットルのPMN懸濁液を1.5ミリリットルのeinorチューブに分注します。

次に、対応するモノクローナル抗体を1ミリリットルあたり10マイクログラムで添加し、氷上で15分間インキュベートします。細胞を洗浄するには、1ミリリットルの冷たいPBS遠心分離機を追加し、上清を吸引します。次に、細胞ペレットを静かに砕き、PBSでさらに2回洗浄します。

未結合の抗体を除去するには、洗浄したPMNを、1ミリリットルあたり60マイクログラムの温かいPBSを含む同じ初期容量の温かいPBSに再度懸濁し、対象の核因子に応じて摂氏37度で1〜20分間インキュベートします。次に、1ミリリットルの冷たいPBSを追加します 遠心分離によって細胞をペレット化した後、スナットを取り外し、細胞ペレットをドライアイスエタノール浴ですぐに凍結します。各サンプルについて、ドライアイスセットエタノールバスワイプからチューブを取り外し、きれいに拭き取ります。

凍結したPMNペレットを100マイクロリットルの冷たい低張液に懸濁します。すべてのサンプルを氷上に置いて、サンプルの核の完全性を監視します。核懸濁液のEloquaをトライアンブルーで染色します。

核懸濁液に無傷の細胞や破片が多数含まれている場合は、調製物を廃棄し、別のサンプルで手順を開始することをお勧めします。遠心分離により核をペレット化した後、上清を非常に慎重に除去し、核を100マイクロリットルの冷たい4%パラホルムアルデヒド溶液に固定し、核を氷上でインキュベートします。核をペレット化した後、100マイクロリットルの冷浸透緩衝液でスナットを慎重に取り出し、サンプルを氷上で10分間インキュベートします。

その後、遠心分離によりperme核を回収します。この時点では、核ペレットはチューブの底にうまく付着しません。未来を再び中心にすることをお勧めします。

ペレットが緩んだ場合 非特異的結合部位をブロックするために、核をPBS中の500マイクロリットルの冷たい4%ウシ胎児血清に懸濁し、氷上で20分間インキュベートします。遠心分離により核をペレット化し、次いで核を再懸濁し、目的の核因子に対するモノクローナル抗体の4%FBSおよび1ミリリットル当たり2.5マイクログラムを含む100マイクロリットルの冷PBSを再懸濁する。サンプルを4%FBSを含む500マイクロリットルの冷たいPBSで2回洗浄した後、氷上で20分間サンプルをインキュベートし、4%FBSを含む100マイクロリットルの冷たいPBSと対応するFZ標識二次抗体の10マイクログラムミリリットルで核を懸濁し、2回の洗浄後20分間氷上でインキュベートし、PBS中の400マイクロリットルの冷たい4%パラアルデヒドに核を再懸濁します。

免疫標識核をファクトスキャンなどのフローサイトメーターまたは同様の装置で解析します。10の対数スケールで2つのFSCを負の196の対数スケールで1つのSSCに、採用プロットのゲート核に取得設定を調整します。サンプルあたり 10 、 000 個の核を取得します。

次に、400の対数スケールで設定されたFL 1チャネルを介して、適性のある染色核の蛍光を分析します。このPMN精製法は、通常、PMN核から95%を超える純度の非刺激好中球を提供し、高収率で単離され、核に単離され、刺激時にドットプロットでフローサイトメーターで無傷のPMNとは異なる集団として容易に認識できる。β 1 インテグリン NF κ B を架橋することにより、核 NF κB のこの増加は蛍光の増加として検出されます。

同様に、β 2インテグリンを架橋することによるPMNの刺激も、蛍光の増加によって示されるように、NFκBの活性化を誘導します。この方法の感度は、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質に結合するβ one integrinsが、他の細胞の接着分子に結合するβ two integrinsよりも強力なNF κB活性化を誘導するという事実によって証明されるように、核因子レベルの小さな変化の検出を可能にします。この方法は、多くの異なる蛍光色素を使用でき、さまざまな細胞タイプから核を調製できるため、このシンプルで経済的なアプローチを、さまざまな細胞タイプの核内のタンパク質レベルの変化を伴うシグナル伝達研究に使用できるため、大きな柔軟性を提供します。