文化における分化したヒト神経前駆細胞からの神経細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

次の実験の全体的な目標は、ヒトのニューロン培養モデルを開発し、ニューロンマーカーを特定し、遺伝子発現分析のためのニューロンの純粋な集団を分離することです。これは、最初にヒト神経前駆細胞を増殖させて、前駆細胞を連続的に供給することによって達成されます。第2のステップとして、神経前駆細胞を、付着因子でコーティングされた皿に分化サプリメントおよび神経栄養成長因子の存在下で培養します。

次に、神経細胞マーカーの免疫蛍光染色を行い、分化した神経前駆細胞の運命を決定します。最後に、PEN膜スライド上で培養されたニューロンのレーザーキャプチャマイクロダイセクションは、ニューロン特異的な遺伝子発現分析を容易にするために実行されます。分化した神経前駆細胞が主にニューロンであることを示す結果が得られました。

免疫蛍光染色とニューロンの捕捉に基づいています。レーザーキャプチャマイクロダイセクションにより、ヒト神経前駆細胞を増殖させ、ニューロンに富んだ培養物に分化させることができます。in vitro研究では、これらの培養物にはいくつかのgal細胞があるため、レーザーキャプチャマイクロダイセクションを使用して、ニューロンの純粋な集団を分離できます。

これらの手順を実演するのは、当社の顕微鏡コア施設のシニアリサーチアソシエイトであるRon Bouchardです。この手順を開始するには、胎児の脳から分離されたヒト神経前駆細胞の凍結ストックを、摂氏37度に急速に温め、次に15ミリリットルの温めた神経基礎培地を含むT75に加え、1ミリリットルあたり10ナノグラム、EG、F、およびFGFを添加して復活させます。細胞を3日間培養した後、ニューロスフェアを15ミリリットルのチューブに移し、遠心分離後5分間1000RPMで遠心分離してペレット化し、上清を捨てて約100マイクロリットルの培地を残し、細胞ペレットをアイノールチューブに移します。

100マイクロリットルのセルペレットは、2つのT 75フラスコに分割するのに十分です。それより少ない場合は、神経前駆細胞が増殖しなくなるため、フラスコの数を減らします。薄く分割する場合は、200マイクロリットルの先端をチューブの底に当てたまま、50回ピペッティングしてニューロスフェアを単一細胞懸濁液に完全に分解します。

顕微鏡を使用して進行状況を視覚的に確認し、ニューロスフェアの解離を確認します。次に、細胞懸濁液を均等に分割し、2つのT75フラスコに加えます。1つは継続的な拡大、もう1つは差別化です。

次に、フラスコをインキュベートします。遠心分離による拡張のためにマークされたフラスコ内の神経前駆細胞の培地を変化させる。次に、古いメディアを破棄し、新しいメディアを追加します。

ニューロスフェアが元のサイズの300〜500ミクロンに達するまで、4〜5日ごとに培地を交換します。ニューロンに富む培養物への神経前駆細胞の分化を開始するには、24ウェルプレートの各ウェルに単一のカバースリップを配置し、それぞれに100マイクログラム/ミリリットルのポリLリジンを500マイクロリットル加えてコーティングします。室温で30分間皿をよくインキュベートし、次にポリオールリジン溶液を吸引します。

プレートを脱イオン滅菌水ですすぎ、再度吸引します。次に、プレートのウェルを5ミリリットルあたり5マイクログラムのマウスラミニンでコーティングし、インキュベーション後30分間インキュベートし、ウェルをPBS吸引液で再度洗浄し、組織培養フードで乾燥させます。細胞を分裂させてから4日後、分化のために標識されたフラスコから小さなニューロスフェアをコーティングされた24ウェルプレートに移します。

ニューロスフェアがディッシュに付着した状態で6時間インキュベートした後、ウェルあたり約500個のニューロスフェアの密度を添加し、増殖培地を除去して分化を添加します。神経基礎培地B 27サプリメントN-G-F-B-D-N-F-D-B-Cおよびレチノイン酸からなる培地。ニューロン分化培地中で神経前駆細胞を2週間培養した後、プレートをインキュベーターに戻すと、ニューロンに富んだ培養物が得られる。

ニューロンをPBSで一度すすぎ、4%パラホルムアルデヒドに30分間固定します。固定したら、PBSで細胞を3回すすぎます。次に、細胞を透過性バッファーと室温で60分間インキュベートすることにより、免疫染色のために細胞を調製します。

次に、PBS中の3%BSA中のポリクローナル抗体とモノクローナル抗体をウェルに添加します。それぞれに異なる抗体ペアを加え、翌朝、シェーカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。カバースリップをPBSで3回洗浄し、インキュベーション後90分間、室温の暗所で抗ウサギP SI 3および抗US fitzy二次抗体とインキュベートします。

カバースリップをPBSで3回洗います。次に、10マイクロリットルの封入剤をスライドガラスの上に置きます。培養皿からカバースリップを取り出し、封入剤の上に逆さまに置きます。

余分な封入剤をやさしく拭き取り、マニキュアで端を密封します。まず、細胞をマイクロダイセクション用に調製するために、神経前駆細胞をPENメンブレン上でニューロンに富んだ培養物に分化させます。ポリLリジンとラミニンでコーティングされたスライド。

その後のすべてのステップは、RNAフリーの条件下で実行します。次に、histo gene stainを使用して培養物を染色し、細胞を可視化します histo gene 染色された核は紫色、細胞質は淡いピンク色で染色され、ニューロンとグリア細胞をそれぞれ異なる形態で区別しやすくします。スライドを75%エタノールと脱イオン滅菌水に30秒間入れます。

次に、スライドをキムワイプに置きます。200マイクロリットルのヒスト遺伝子を加え、20秒間待ちます。次に、スライドを脱イオン滅菌水、75%エタノール、95%エタノール、および100%エタノールにそれぞれ30秒間順次配置します。

次に、キシレンに5分間置き、キムワイプで5分間乾かします。次に、通常のスライドの上にPENメンブレンスライドを置き、ソフトウェアを使用してVeritasレーザーキャプチャマイクロダイセクションシステムまたはLCMに配置します。ロードマップ画像を撮影して、アストロサイトが存在しない純粋なニューロン集団の領域を見つけます。

描画ツールを使用してこれらのニューロンをマークします。次に、コンピューター制御の精度と自動化を使用して、これらの領域のレーザーキャプチャを2段階のプロセスで実行します。まず、IRは、70ミリワットのレーザー出力設定と2, 500マイクロ秒のパルスで複数のスポットで発射され、膜をキャップに取り付けます。

次に、マークされた領域をUV切断ツールを使用して、10ミリボルトの低レベル設定で切除します。これらのプロセスの組み合わせにより、マークされた領域がキャプチャLCMマクロキャップに選択的にキャプチャされます。最低100個のニューロンが捕捉されたら、顕微鏡を使用してキャップからメンブレンを取り出し、チューブの上に置きます。

P OPU RNA単離キットを使用してLCMサンプルから全RNAを単離し、DNAで処理します。次に、キットの指示に従って、ribo amp RNA増幅キットを使用して単離されたRNAを増幅します。最後に、TAC MANプローブを使用してリアルタイムのR-T-P-C-R分析を行い、ヒトのニューロフィラメント重鎖を検出します。

ニューロンに富んだ培養物は、ポリLリジンとラミネートコーティングされた表面を分化特異的な成長因子と組み合わせて使用し、4日齢のニューロスフェアを分化することによって得られます。2週間後、ここに示すニューロンに富んだ培養物が低密度の領域で得られます。細胞は、ここで見られるようなアストロサイトに分化する可能性があります。

アストロサイトの分化は、ニューロンの分化に使用されるものの代わりに成長因子CNTFを使用することによっても指示することができます。ニューロンの分化は、特異的なニューロンマーカー、新規Nおよびシナプシン、アセチルコリンエステラーゼおよびシナプトフィジン、ならびにBDNFおよびGAAPに対する抗体を用いて同定することができ、43陽性染色は、分化した細胞が初代ニューロンの特性を有することの証拠である。さらに、アストロサイトは、ポジティブスタット3およびGAP免疫染色によって同定できます。

ニューロンのレーザーキャプチャマイクロダイセクションは、ポリLリジンおよびラミニンコーティングPEN膜上で分化した細胞上で行われます ここに示すスライドは、ヒスト染色で染色されたニューロンです。細胞を視覚化するために、レーザーを使用して目的の細胞の輪郭を描くことができ、レーザーによってPEN膜が溶け、その上に配置されたキャプチャキャップに固着します。最終的には、多数の細胞を同じキャップにアウトライン化して捕捉し、DNAまたはRNA分析を行うことができます。

このビデオを見れば、レーザーキャプチャマイクロダイセクションを使用してニューロンを分離する方法を十分に理解できるはずです。