設立インビトロシステムの細胞内挙動を研究するために、カンジダ·グラブラタ人間のTHP-1マクロファージにおける

この手順の全体的な目標は、ヒト日和見真菌病原体の細胞内挙動を研究するためのin vitro培養モデルシステムを確立することです。Canida labは、ヒト単球細胞株TP oneに由来するマクロファージのラッタです。このTHPを達成するために、1つの単球を最初に4つのエステルで処理してマクロファージに分化させます。

次に、THP 1マクロファージは、感染後2時間でcanida GTA細胞に感染します。非食作用のあるcanida GTA細胞はPBSワッシャーによって除去され、細胞内電子細胞は感染したマクロファージの浸透膜によるさらなる研究のために回収されます。このプロトコールは、マクロファージ中のウイルスからcanida GTA細胞、ならびにカンジダGTA感染時のマクロFIDS上のTHPにおけるfaiz成熟ロスおよびサイトカイン応答の両方を評価するために使用することができます。

さらに、このプロトコルは、TSP 1マクロファージの生存プロファイルの変化についてカンジダ協力変異体ライブラリをセミハイスループット方式でスクリーニングするためにスケールアップできます。このプロトコルの主な利点は、比較的安価で、再現性が高く、さまざまな免疫細胞や真菌性病原体に容易に適応できることです。感染の2日前に手順を開始するには、初日にTHPと単球細胞を80%COにし、培養リスクを取り除き、ゆっくりと穏やかにすべての微妙な細胞を懸濁させます。

DHP 1単球細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移します。遠心分離機 室温で細胞懸濁液を4分間 1000 RPMで、メディウムを廃棄物容器に入れ、5 mlのプレAPIメディウムをチューブに入れて再充填します。THV 1細胞ペレットを、培地を3回4回穏やかにピペッティングして懸濁します。

ヘモサイトメーターを使用して細胞密度を決定するために細胞懸濁液の10マイクロリットルを取り、細胞密度を1ミリリットルあたり100万細胞に調整します。 細胞懸濁液1マイクロリットルの60マイクロモルPMAストック溶液を1マイクロリットル加えて、最終濃度が16ナノモルになるようにし、よく混合します。100万個の細胞に対応する1 mLの細胞懸濁液を24ウェル組織培養プレートの各ウェルに分注し、摂氏37度、CO2 5%に設定されたインキュベーターに移します。

12時間のインキュベーション後、古い培地を廃棄します。各ウェルに1 mLのプレRPI培地を加え、プレートをさらに12時間インキュベートします。これらの細胞は、後で説明するカナダの感染症に使用されます。

適切な微生物学的手法を用いて、単一のEAコロニーをML YPD培地を含むフラスに接種します。インキュベーション遠心分離機の後、摂氏30度に設定されたインキュベーターでフラスを14〜16時間インキュベートします。1 ML 培養液を 4 、 000 RPM で 5 分間。

sup natinを捨て、滅菌PBSでシェルを3回洗います。洗浄バッファーを廃棄した後、穏やかなピペッティングにより、細胞パレットを1 mLの滅菌PBSに懸濁します。次に、600ナノメートルの分光光度計で細胞懸濁液の吸光度を測定し、PBSを使用して細胞密度を1mlあたり200万細胞に調整します。

細胞懸濁液の50マイクロリットルを取り、PBSスプレッドプレートで100マイクロリットルの培養物をYPD AGA培地で100倍に希釈します。プレートを摂氏30度でインキュベートし、1日または2日後にYPDプレートに現れたコロニーの数を数え、この数に適切な希釈係数を掛けて、ゼロ時間のコロニー形成単位を計算します。Canada Retaのこれらの多くのコロニー形成単位は、マクロファージ上のDHEに感染するために使用されます。

次のステップでは、24クジラ培養プレートのマクロファージ単層に50マクロリットルのカナダクレーター細胞懸濁液を追加します。プレートを土壌して各細胞を均等に分布させ、2時間のインキュベーション後に摂氏37度でインキュベートします。培養プレートをmlシリアルPBSで培養プレートの各ウェルの容器に反転させることにより培地を廃棄し、ウェルウェルの側面に沿って慎重に徹底的にバッファーを廃棄します。

この手順をさらに 2 回繰り返します。次に、最初のウェルを除いて、感染後4、6、12、および24時間でカンジダ性細胞の細胞内複製をモニターするために使用できる他のすべてのウェルに1つのMLRPI培地を追加し、マクロファージ感染の2時間後に細胞内電子細胞を回復させ、1つのMLシリアル水をphosに追加します。2分後、1つのMLパイパーチップでウェルを優しくこすり落とし、ウェルのマクロファージの破片を取り除きます。

井戸をすすぎ、マクロ中心の魚管に集めます。PBS中のmicroFIT細胞ライセートを100倍希釈して調製し、YPD AGA培地に100マイクロリットルをプレート化します。プレートを摂氏30度で1〜2日間インキュベートし、コロニー形成単位の数を数えます。

この数値に適切な希釈係数を掛けて、食作用のあるcanida ator細胞の数にT-2を掛け、2時間の感染後にマクロファージを数えます。同様に、細胞内canida ator細胞の数は、異なる時点で決定できます。感染後および細胞内複製は、ここに示されている 2 時間で内部化された CFU と比較して、24 時間での増加として表すことができます。

典型的な実験の他の結果では、TVに感染したイヌワニガニ細胞の総数は、10の6倍、4つにつき2つです。2時間後に回収された細胞の数は3.7で、10.4の6倍です。したがって、e細胞は、24時間の同時インキュベーション期間中に62.66%の割合で貪食されることを示しています。

細胞内電子細胞の数が10.4の3.76倍から10.5の1.96倍に増加したため、5.2倍の複製以外の細胞は可能です。この実験では、イヌ科のTER細胞の細胞内複製をGFP発現E細胞を用いて評価し、共焦点顕微鏡で観察することもできます。24ウェル培養プレートについて前述したプロトコルを使用して、4チャンバースライドでTHVとマクロファージを調製し、感染させます。

感染後2時間。スライドをスライドの各チャンバーに500マイクロリットルPBSで廃棄物容器に反転させることにより、媒体を廃棄します。よくすすぎ、PBSを捨てます。

この手順を500マイクロリットル、フォーマル高さ3.7%でさらに2回繰り返して、細胞を固定します。スライドを室温で20分間インキュベートし、フォーマルなde Heightを廃棄します。500マイクロリットルのPBSで各ウェルの価格を洗浄し、5分間のインキュベーション後に500マイクロリットルのトリトンXでマクロファージをパーメ動員し、トリトンXを取り外してPBSでウェルストライクを洗浄します。

チャンバー取り外しとエアライダースライドを使用してチャンバースライドを慎重に分解します。スライドの各セクターにDPIを含むベクターシールド封入剤を1滴置き、カバースリップを取り付け、共焦点顕微鏡で可視化した細胞をネイルペイントでシールします。ここに示されているのは、野生型のカニダ実験室細胞を発現するGFEに感染したTP 1マクロファージの代表的な共焦点画像であり、細胞内電子細胞の数が2時間から24時間で約6倍に増加し、TP 1マクロファージシグネチャータグ変異誘発アプローチは、微生物病原体の尿素因子を特定するために広く使用されています。そこでは、多数の変異体がユニークなオリゴヌクレオチドを介して成長欠陥について同時にスクリーニングされますsequence タグ。

ここでは、Canada Libraryとmutant libraryのSTMスクリーニングのプロトコルについて、以下の3つのステップから構成されています。最初の96プラスミド。それぞれが独自のオリゴヌクレオチド配列スタックを持ち、ナイロンメンブレンに固定化されています。

第 2 ステップでは、96 個の CANIDA ator 変異体のプールで、THV 1 マクロファージの生存プロファイルの変化についてスクリーニングされ、続いて YPD、増殖およびマクロファージの内在化変異体 e 細胞が回収されます。これは、それぞれ入力サンプルと出力サンプルと呼ばれます。最後に、DNAシグネチャータグは、入力および出力ゲノムDNAサンプルからPCI増幅および無線標識されます。PCR産物を固有のタグにハイブリダイズし、メンブレン上の放射性シグナルを定量して分析します。

96 12ドットボード装置を組み立てるには、湿ったスワップウィンドツリーペーパーの上に濡れたナイロンメンブレンを置き、ユニットのネジを締めます。メンブレンを滅菌水で洗浄し、続いて0.4μの水酸化ナトリウムで洗浄します。200モルの水酸化ナトリウム洗浄に続いて、96 12ブロックからドット血液apptusの対応するウェルにPLA BDNA溶液の96ナノグラムを移します。

UV架橋剤で転写された血漿BDNAを膜に交差させる2つのXXSCの参照後に、ドット血液装置から膜を取り外してください。インキュベート メンブレンを触角プレハイブリダイゼーション、バッファー、インプット、UNEボトルに入れ、摂氏42度で2時間。インプットおよびアウトプットのセルパレットおよびプライマーから抽出したゲノムDNAを、ユニークなタグのインバート隣接領域に対してPCRでラジオレベルプローブを調製します。

ラジオラベルのプローブを摂氏99度で5分間変性させ、氷上でゲルをスナップします。deプローブをインプットボトルとアウトプットボトルに移し、摂氏42度で14〜16時間インキュベートします。ハイブリダイゼーション後。

プロトコルに記載されているように、入力メンブレムとアウトプットメンブレムを洗浄します。ボトルからメンブレンを取り出し、自然乾燥させ、リン酸化画像スクリーンにさらします。2〜3時間後、リンスクリーンをスキャンして画像を取得します。

この例では、2つのハイブリダイズド膜フィルターが示されており、これは、96匹のcanida Gatory変異体の1つのプールの生存率の変化に対するスクリーニングを表しています。thv 1では、マクロファージを定量化し、出力上の各スポットのシグナル強度と入力膜の比を決定したところ、タグ番号13、26、75、および85が出力で過小評価されていることが明らかになりました。これらのスタックは赤で囲まれており、4つの異なるミュータントの成長を反映しています。

対照的に、緑色で強調表示された一意のシーケンス 11 と 81 でスタックする変異体は、出力サンプルで過剰に表現されています。言い換えれば、この画面から、96個の変異体のプールでは、2つの変異体が生存率を高め、4つの変異体がマクロファージの成長時に現れるはずです。このようなプールスクリーニングで同定された生存表現型の変化は、単一感染アッセイで検証する必要があります。

このビデオを見た後、関心のある真菌病原体の増殖内プロファイルを研究するためのin vitro経口システムをどのように制定するかについてよく理解しているはずです。また、現在では、このシステムを使用して大規模な変異体プールスクリーニングを実施できるはずです。