培養胚のための方法 C.虫細胞

この手順の全体的な目標は、in vitro、胚、海のエレガントな細胞を解離して培養することです。これは、最初に大量の墓動物を育てることによって達成されます。次に、卵子は成虫から分離されます。

次に、卵をキチナーゼで処理して卵殻を溶かします。最後に、細胞を手動で解離し、培養のためにプレーティングします。最終的には、免疫蛍光法、顕微鏡法、電気生理学、およびカルシウムイメージング技術を通じて、細胞特異的マーカーの発現を示す結果を得ることができます。

手順をデモンストレーションするのは、ポスドクの研究室であるreltiです。GRの大人の段階に海の優雅の少なくとも4つのプレートを培養し、テキストプロトコルに従って培地と溶液を準備した後。卵の分離は、まず、事前に調製したピーナッツレクチンストック溶液のチューブをホーイングすることから始めます。

オートクレーブカバースリップを24ウェルプレートのウェルに置き、各カバースリップに200マイクロリットルのピーナッツレクチンを加え、室温で少なくとも1時間インキュベートします。次に、溶液を吸引し、滅菌水を使用してウェルを洗浄します。ピーナッツレクチンの痕跡をすべて取り除いたら、細胞の凝集を防ぎます。

次に、滅菌オートクレーブ水を使用して、GR成虫を寒天プレートから洗い流し、懸濁液を2本の滅菌円錐形50ミリリットルチューブに集めます。チューブを最大5分間氷の上に置いて、ワームが底に落ち着くようにします トランスファーピペットで水を取り除き、新鮮な滅菌オートクレーブ水遠心分離機と交換します。ワームを200 Gで10分間観察します。

最終洗浄後、葬液を新鮮な滅菌水に懸濁し、滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に移してから、再び200Gで10分間回転させます。ワームが完全にペレット化されていない場合は、チューブを氷の上に5分間置きます。ワームが完全に落ち着いたら、水を取り除き、5〜6ミリリットルの溶解液を追加します。

次に、懸濁液を5〜10分間静かに揺さぶり、2〜3分ごとに懸濁液を一滴垂らし、実体顕微鏡で溶解を確認します。ワームの72 80%が溶解されたら、この時点から回転する前に9ミリリットルの卵バッファーを追加して溶解反応を停止し、ブンゼンバーナーを点灯させて卵の再汚染を防ぎ、上清を慎重に取り除き、卵バッファーを使用してペレットを3〜4回徹底的に洗浄します溶液が透明になるまで。次に、動物の死骸から卵を分離するために最終的な上清を取り除いた後、ペレットを2ミリリットルの滅菌卵緩衝液に懸濁し、2ミリリットルの60%スクロースを卵緩衝液に加えます。

卵を溶液でよく混ぜてから、20分間遠心分離します。200 Gで、チューブを遠心分離機から慎重に取り外します。卵は溶液の上部に浮かんでいます。

したがって、ピペッターと滅菌1ミリリットルの先端を使用して、卵を新鮮な滅菌15ミリリットルの円錐管に移します。滅菌卵バッファーを使用して、層流フードの下で作業しながら卵を3回洗浄します。細菌汚染の導入を避けるために、ペレット卵を1ミリリットルあたり2ミリグラムのキナーゼの1ミリリットルに懸濁し、それらを新鮮な15ミリリットルの円錐管に移します。

卵殻の約80%が消化される酵素の鮮度に応じて、室温でチューブを10〜30分間揺さぶります。卵を900Gで3分間遠心分離します。上清を慎重に取り除いた後、3ミリリットルのL 15培地を加え、卵を直径6センチメートルのプレートに移し、18ゲージの針を備えた10ミリリットルの滅菌注射器を使用して手動解離を開始します。

解離の程度を監視するには、懸濁液を新鮮なペトリ皿に一滴入れ、顕微鏡で観察します。細胞の約80%が解離するまで続けます。細胞のしこり、未消化の卵、および孵化した幼虫を除去するには、懸濁液を5ミクロンのフィルターで穏やかにろ過し、さらに4〜5ミリリットルのL 15培地をフィルターに通して細胞を回収し、細胞を培養します。

濾液を900Gで3分間遠心分離した後、細胞を完全なL 15培地に懸濁し、ウェルあたり1ミリリットル再生し、周囲空気中の摂氏20度の湿度の高い密閉チャンバーにプレートを保存します。単離された胚性エレガンを分化するためには、細胞が基質に付着しなければならない。分化プロセスは、めっき後約2〜3時間で始まり、約24時間続きます。

in vitroでの形態学的特徴は、in vivoの形態学的特徴と非常によく似ています。例えば、ここに示すように、LMニューロンとPLMタッチニューロンは、in vivoのように2つのニューロンプロセスしか発達せず、一方が他方よりも長くなります。このことは、エレガン細胞の分化を促進する分子メカニズムの少なくとも一部は細胞自律性であり、したがって再現可能であることを示唆しています。

In vitro タンパク質マーカーや細胞特異的な翻訳後修飾も in vitro で観察できます。例えば、αチューブリンは、ここで示されるように、シーエルガンの触覚ニューロンにおいて、飽和した触覚ニューロンのプロセスのみが、飽和したαチューブリンに対して産生された抗体で染色される。また、このパネルに見られるように、培養されたタッチニューロンは毒性のある変異体チャネルであるMEC four Dを発現しており、これは実際に生体内でタッチニューロンを死滅させます。

MEC 4 DPE 4G FP株から調製されたGFP発現ニューロンは、最初は培養中に存在しますが、その後変性します。しかし、in vivoと同様に、ここに示すようにIDEとダントロレンによる処理により、細胞を死から救うことができます。パッチクランプ法は、ウミエルガン培養細胞におけるカリウムオン酸、オン酸、非選択的およびドーパミントランスポーター依存性チャネルの研究に使用されます。

セルのサイズが小さいため、ガラスピペットには小さな先端と幅の広いコーンが必要であり、入力抵抗の増加を相殺する必要があります。さらに、ピペットの先端の下にあるメンブレンのパッチに高電圧インパルスを印加することで、細胞を損傷する可能性のある吸引によって細胞全体にアクセスを得るよりも、より大きな成功を収めることができます。この図では、電位依存性カルシウムチャネルの役割を研究するために、イオン4を使用して膜を透過し、カルシウムの不在または存在下でのカルシウムイメージングのためにカメレオンYC2ポイント12を発現するタッチニューロンを較正します。

また、タッチニューロンの平均遊離カルシウム濃度は200ナノモルモルであることが分かった。このビデオを見れば、単離とvitroの培養方法についてよく理解できるはずです。エレガンス、胚細胞を参照してください。