蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

この手順の全体的な目標は、固定細胞または生細胞で複数のタンパク質種をナノメートルの精度で同時にイメージングすることです。これは、顕微鏡からの焦点の合った画像がカメラチップに投影されるまで、最初にカメラと光学系の位置を調整することによって実現されます。2番目のステップは、レーザービームを顕微鏡ステージ上のサンプルに直接位置合わせするように配置することです。

次に、調製した細胞サンプルを照射し、目的のタンパク質を発現する細胞を選択します。最後のステップは、サンプルにレーザーを照射することにより、蛍光光活性化局在顕微鏡で細胞をイメージングし、次に細胞の蛍光をカメラチップに向けてデータセットセットを取得することです。最終的に、蛍光光活性化局在化顕微鏡法は、固定細胞または生細胞、広視野、または全反射蛍光を使用してサンプルの薄い領域を単離する際に、ナノメートル空間スケールで複数のタンパク質種の局在を示すために使用されます。

共焦点顕微鏡や電子顕微鏡などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、固定細胞または生細胞でナノメートルの分解能で複数のタンパク質を同時にイメージングできることです。次の手順は、ここに示す番号付けシステムを参照しており、これは、付属のテキストプロトコルの図1として提供されているマルチカラーF Omセットアップの概略図であり、顕微鏡を位置合わせすることから始まります。まず、10 x対物レンズを配置し、ランプを透過光用に設定した顕微鏡ステージにキャリブレーションスケールまたはラジカルを配置します。視野の中央に垂直を中央に配置します。

次に、視野の開口部を閉じ、垂直の接眼レンズを通して観察することにより、顕微鏡をコア照明用に調整します。フィールドアパーチャのエッジにピントが合っていない場合は、フィールドアパーチャと赤みの両方にピントが合うまでコンデンサーの高さを調整します。次に、視野開口部の横方向の位置を調整して、視野に対して中央に配置され、赤目の中央グリッドのみが照らされるまで視野開口部を閉じます。

これらのコンポーネントを初めて組み立てるときは、各チャネルのパス長を等しくなるように調整します。このプロジェクトを達成するために、カメラチップ調整ミラー7と9の赤みを出し、検出絞りを閉じて、2つのチャンネル間の空間的な重なりを防ぎます。次に、反射光チャネルでラジカルの画像に焦点を合わせ、透過光チャネルでも焦点が合っているかどうかを確認します。

透過光チャネルの像にピントが合っていない場合は、ラジカル像が両方のチャネルで同時に焦点が合うまでミラー9を平行移動します。レーザー光路からレンズ1を取り外し、活性化ビームと読み出しビームをブロックして、レーザーの位置合わせを開始します。次に、白いカードをミラー4と同じ高さに置き、顕微鏡のシャッターを開いて、ラジカルイメージがミラー4の前のカードに投影されるまで焦点を合わせます。

次に、読み出しビームのブロックを解除し、ミラー 1 を調整して、読み出しレーザーをミラー 4 のラジカル画像の十字線の中央に配置します。中央に配置したら、ラジカル画像をミラー 5 に投影し、ビームがミラー 5 のイメージの十字線の中心に来るまでミラー 4 を調整します。読み出しビームは、M 4 と M 5 の両方の中心に配置されるはずです。

次に、シャッター1を閉じて読み出しビームをブロックします。次に、ラジカルイメージをミラー3に投影します。ビームエキスパンダーをレーザーパスから取り外し、活性化レーザーのブロックを解除します。

次に、ミラー 2 を調整して、ミラー 3 のラジカル イメージの十字線に活性化ビームを中央に配置します。中央に配置されたら、ビームエキスパンダーをミラー2とミラー3の間で交換し、ビームがラジカルイメージの十字線の中心に来るまでビームエキスパンダーの位置を調整します。ミラー3で、ラジカルイメージをミラー5に投影し、ピントを合わせます。

顕微鏡のフォーカスノブを使用して、活性化ビームが赤みのある画像の中心に来るまで、ダイクロイックミラー番号1の角度を調整します。次に、対物レンズを設置せずにシャッター2を閉じ、顕微鏡のシャッターを開いて、活性化レーザーをブロックします。読み出しシャッターシャッターを開き、顕微鏡の背面絞りからレーザーを投影します。

ビームが顕微鏡から出てくるまでミラー5を調整し、ビームが顕微鏡から垂直に出て、レンズ1と対物レンズが元の位置に戻るようにします。100マイクロモルの臭素Bを含むサンプルを、活性化レーザーをブロックしたステージに置きます。読み出したレーザーを60倍対物レンズを通して色素に投影します。

電子増倍ゲインが無効になっています。この画像をカメラに送信します。次に、対物レンズをサンプルに焦点を絞ります。

開口部を十分に広く開いて、ビームプロファイル全体をイメージングできるようにします。次に、ビームプロファイルとアパーチャの中心が同心になるように、アパーチャを横方向に移動します。カメラソフトウェアを使用して、関心領域を選択して、両方のチャンネルをカプセル化する最小のカメラ読み出し領域を許可し、これらの座標を記録します。

この時点で、読み出しビームプロファイルを表す単一のスナップショットを記録します。次に、シャッター1を閉じ、シャッター2を開いて読み出したレーザーをブロックします。活性化ビームプロファイルの測定を開始するには、必要に応じて、活性化レーザーをサンプルに投影し、電子増倍ゲインを100未満にし、ビームが各視野の中心に来るまで最初のダイクロイックミラーを調整します。

次に、マルチカラーFパーム画像の取得を開始するために、活性化ビームプロファイルのスナップショットを記録します。すべての部屋の照明を消します。次に、フリップマウントを介して水銀ランプをトランスフェクションされたセルに投影し、フィルターキューブをプレフォトスイッチの適切な励起波長を含むものに変更します。状態。

セルを選択したら、レーザーが顕微鏡に通過できるようにフリップマウントを下に移動し、付属のテキストプロトコルで説明されているように、フィルタータレットをイメージング用の適切なダイクロイックミラーを含むものに変更します。次に、この画像をカメラに投影して、トランスフェクションされた細胞をバックグラウンド蛍光と区別し、分子が光可能であることを確認します。活性化レーザーから10マイクロワット未満の低電力でサンプルを短時間照らします。

次に、電子乗算ゲームを200に設定し、フレームの所望の数を5と10, 000の間に設定することにより、キネティックシリーズ取得用のカメラソフトウェアを準備します。また、露出を 10 ミリ秒から 30 ミリ秒の間に設定します。次に、活性化ビームをブロックし、読み出しビームのブロックを解除し、照らされたセルの画像をカメラに投影します。

個々の分子が見えなくなるまで焦点を下にずらして、細胞膜下部の近くの焦点面を選択します。次に、分子が最初に見えるようになるまで、焦点を徐々に上に動かします。次に、活性化ビームのブロックを解除し、強度1平方センチメートルあたり1ワット未満でサンプルを照らします。

活性化レーザーの前にあるNDフィルターを動的に調整することにより、1平方ミクロンあたり0.1〜1の可視光性分子の密度を維持しながら、カメラソフトウェアを介してこれらのデータを取得し始めます。全反射蛍光イメージングの場合、ミラー5個とレンズ1個を1つの並進ステージに取り付けて、顕微鏡の入り口のすぐ後ろに横方向に移動させます。ミラー5とレンズ1が並進すると、対物レンズからサンプルを上向きに出るレーザーは徐々に片側に傾き、レーザーの角度が垂直から90度に達するまでステージを平行移動し続けます。

この時点で、出現するレーザー自体が消え、入射するレーザーは、入射ビームに反平行に移動する開口に再び反射され、横に変位します。画像取得の完了時にサンプルが全反射蛍光に入ると、バックグラウンドが減少するはずです。すぐに顕微鏡のシャッターを閉じて、両方のビームを遮断します。電子乗算ゲインを無効にします。

カメラを 1 フレームを記録するように設定し、カメラの読み出し領域を最大サイズに設定します。最後に、顕微鏡ランプに取り付けられたロングパスフィルターで、カードをF 3またはF 4の上に置いて、1つのチャンネルをブロックします。サンプルを照らし、この画像をカメラに投影します。

セルのスナップショットを記録して、透過光でセル全体を表します。ここに示されているのは、DENDRA 2ヘマグルチニンおよびPAMチェリーアクチンの両方を発現するNIH three T、3細胞の2色Fパーム取得の例である。左側の送信チャネルには、右側の反射チャネルよりも長い波長が含まれています。

ここに示されているのは、バックグラウンド、減算、および変換に続いて、左右のチャネルを重ね合わせた同じ 2 色の F OM 取得のスナップショットです。個々の分子を同定し、局在化することができます。一部の分子は透過チャネルでより明るく見え、一部の分子は2つのチャネル間でより均一な発光分布を示します。

これは、PAMチェリーとDENDRAの2つの発光スペクトルの違いを示しており、これら2つの種を特定するための分析に使用されます。ここに示すヒストグラムは、許容誤差が適用された後のすべての局在化分子について、赤色の透過チャネル強度を全強度で割った比率を示しています。ピクセルは、左下の画像では白く表示され、右下に表示されている最終的なマージ イメージでは赤で表示されます。一方、緑の領域のピクセルは右上のイメージでは白で示され、右下に表示されている最終的なマージ イメージでは緑色で表示されます。

レンダリング時に選択されるしきい値レベルは、ノイズの程度と共局在化の外観に大きく影響します。表示。ここでは、レンダリングの 3 つの異なるオプションを示しており、最も保守的なしきい値レベルを通じてさまざまな程度のブリードが発生し、下部の 2 つに示されています。カラーFパームアルファヒストグラムは、画像に2つの識別可能なピークがある場合に解釈するのが最適です。

左側のヒストグラムはさらなる分析の候補として適していますが、この手順に従うと、他の 2 つのヒストグラムから得られる画像の解釈がはるかに困難になります。全反射法、顕微鏡法、生細胞イメージングなどの方法は、生細胞膜のナノスケールでタンパク質がどのように組織化されているかなどの追加の質問に答えるために実行できます。このビデオを見れば、独自のFAR顕微鏡をセットアップし、それを使用してデータを取得する方法について十分に理解できるはずです。

レーザーでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を試みる前に安全トレーニングを完了する必要があることを忘れないでください。