変換にマトリックス支援レーザー脱離/イオンイメージングのためのマトリックスとしてジスラノールはイオンサイクロトロン共鳴質量分析計をフーリエ

この手順では、ウシの水晶体内の複数の内因性脂質を空間的に局在化します。マトリックス支援レーザー脱着イオン化の技術を使用して、質量分析イメージング。まず、薄いウシ水晶体組織切片を作製し、multi matrixxを適用してから、maldi質量スペクトルデータセットを取得します。

データセットを処理して、水晶体組織切片で検出された脂質を視覚的に表現します。これらの結果を組み合わせることで、ウシのレンズ内の脂質の位置と相対的な存在量を決定し、この分布を視覚的に表現することができます脂質抽出とLCMS分析などの他の方法と比較して、マルディ質量分析イメージングは、空間的な局在を失うことなく複数の脂質を同時に視覚化することができます。フラッシュ凍結した組織標本をマイナス80°Cの保管から取り出します。

レンズの表面からカプセルを取り外して、ウシのふくらはぎのレンズ部分全体を固定します。クライオスタットの組織切断ステージに1滴または2滴の水を置きます。クライオスタットが最適な温度に平衡化したら、レンズが固まる前にレンズを水中にすばやく置きます。

組織を赤道方向に20ミクロンの厚さのセクションに切断します。最初の組織切片を破棄し、眼球体組織のイメージングには赤道面に近いスライスまたは赤道面を追加するスライスのみを使用します。1.5マイクロリットルのギ酸を加えて、ITOコーティングされたスライドガラスの表面を事前に濡らします。

次に、組織切片をクライオスタット内のスライドに慎重に移します。次に、マルディマトリックスを適用する前に、スライドを15分間凍結乾燥します。修正液ペンを使用して、ITOコーティングされたスライドガラスの非導電性表面に3つのティーチングマークを追加します。

次に、フラットベッドスキャナーを使用して組織スライドの光学画像を撮影し、TIFFやjpegなどの適切な形式で保存します。まず、ITOコーティングされたスライドガラスの前面の端をテープで覆い、マトリックスがスライドの端をコーティングしないようにします。適切な溶媒で使用するマトリックスを調製します。

次に、組織切片の表面にマトリックス溶液を塗布します。スライドガラスを20サイクルのマトリックスコーティングを使用してコーティングします。あるいは、溶媒が電子マトリックス噴霧器と互換性がない場合、空気圧アシストエアブラシ噴霧器を使用してマトリックスを塗布することもできます。

質量校正溶液については、ESチューニングミックス標準溶液を60%で1〜200倍に希釈しますイソプロパノールは、希釈されたESチューニングミックス溶液の1分あたり2マイクロリットルをデュアルモードエレクトロスプレーイオン化イオン源に導入し、4つの変換イオンサイクロトロン共鳴ms.広帯域検出と1024キロバイトのデータ収集サイズを備えたポジティブイオンESIモードでF-T-I-C-R装置を操作します秒速。通常、ESIパラメータは3、900ボルトのキャピラリーエレクトロスプレー電圧に設定します。

3, 600ボルトの噴霧シールド電圧ネブライザー窒素ガスは、毎分2リットルで流れます。乾燥窒素ガスは毎分4リットル、温度は摂氏200度で流れます。また、スキマーの電圧を15ボルトに設定します。

飛行時間は0.01秒、衝突アルゴンガスの流れは毎秒0.4リットル、ソースイオン蓄積時間は0.1秒、衝突セルイオン蓄積時間は0.2秒です。次に、F-T-I-C-R操作パラメータを調整して、質量電荷比200から1400までの質量範囲で分析感度を最大化し、良好な時間領域フリー誘導減衰信号を維持します。次に、ESI質量スペクトルを取得し、E esチューニングミックス溶液中の標準化合物の参照質量を使用して装置をキャリブレーションします。

MALDI操作用に装置を調整するには、混合トゥリンとINE標準溶液の1マイクロリットルアリコートをそれぞれ1マイクロモルの濃度でマトリックス溶液に溶解し、これらの溶液をサンプル組織切片の1つに直接スポットします。スライドをティッシュスライドアダプターに入れ、MALDI側からデュアルESIマルディイオン源にアダプターをロードします。次に、各マススキャンのレーザー出力とMALDI信号蓄積のレーザーショット数に適切なMALDI動作パラメータを最適化します。

maldi MSI実験用に装置をチューニング、キャリブレーション、最適化した後、イメージングソフトウェア内で記録された光学画像とイメージングする組織切片の物理的な位置を位置合わせします。3 点三角測量法を使用して、3 つの補正液マーキングを位置合わせします。次に、ESI MALDIの同時操作を開始し、各マススペクトルにE ESチューニングミックス溶液のリファレンスマスピークが含まれるようにして、取得後の内部質量キャリブレーションを行います。

まず、MALDI信号がスペクトルを支配するまでキャピラリー電圧を下げてESI信号を減衰させますが、ESIキャリバー信号は内部質量キャリブレーションに十分な高さです。次に、放射線のレーザーの自動レイシング方法を設定します。ランダム スポット分析を使用します。

イメージングする組織領域を定義し、適切なレーザーRAステップサイズを設定します。初期比較のために内部キャリブレーションを使用してMALDIマススペクトルをキャリブレーションし、MSMSデ同位体のピークを選択し、カスタマイズされたVBAスクリプトを使用してモノ同位体ピークを選択し、結果のモノアイソトピックピークリストをエクスポートします。測定した質量と電荷比の値をMelin nineおよびHMDBメタボロームデータベースに入力し、ライブラリエントリと質量をマッチングします。

次に、ピーク頂点で質量フィルター幅が100万分の1のイメージングソフトウェアを使用して、組織切片全体で検出されたすべての脂質エンティティのマルディ画像を生成します。データベースエントリに一致するすべての質量電荷比の値について画像が生成されると、他のすべてのピークについても画像が生成され、ウシのレンズなどの特定の組織について後で調査できる独自の分布パターンを探します。組織の広範な裂傷は、直接融解マウントを使用するとよく観察されます。

エタノールまたはギ酸を使用したIT OASスライドのプレコは、組織マウント中に組織切片の完全性を維持するのに役立ちます。マトリックスの選択と溶媒の選択は、MALDIスペクトルの品質に影響を与える重要な要素です。これらの例では、効率的なマトリックス溶媒で生成されたスペクトルと、ジオールのマトリックス溶媒の選択が不十分な場合を比較しています。

Maldi MSI実験からマススペクトルのセットが取得されると、検出された各イオンの画像を生成できます。各ピクセルは、組織切片の表面からのレーザー照射スポットを表しています。分析種の相対濃度は、組織切片のさまざまな部分で詳細に説明できます。

ほとんどの実験では、データは各スペクトル内の総イオン電流で正規化されます。この正規化領域とより優れた分析種マトリックスがないと、COCの結晶化により分析物のシグナルが強くなり、データが歪む可能性があります。また、組織の準備は、生成される画像を劇的に変えることもあります。

サンプルが湿りすぎると、分析物が組織上で非局在化し、空間情報の多くが失われます。この眼レンズでの組織イメージング実験のデモンストレーションでは、ジオールをマルチMatrixxとして使用して、F-T-I-C-R-M-Sによる脂質の空間分布を決定しました。異なる種類の組織における脂質のイメージングは、同様の方法でジオールまたは別のマトリックスを使用して達成できます。