1次元および2次元^1HNMRを用いたペプチド-金属錯体の構造と配位決定

この手順の全体的な目標は、銅と複合体を形成したメタロシャペロンタンパク質模倣ペプチドの構造を決定することです。これは、まず無酸素環境でサンプルを調製することによって達成されます。第2のステップは、水素原子間の相互作用を示す核磁気共鳴またはNMR分光データを取得することです。

次に、空間的相互作用を線状ペプチドテンプレートにマッピングします。最後のステップは、データに適した代表的な低エネルギー構造を見つけることです。最終的に、NMR由来の構造は、結合のモードを決定し、銅結合錯体の構造分析を実行するために使用されます。

この手法がX線結晶構造解析などの既存の技術よりも優れている点は、毎週の結合複合体や、結晶化しない分子や複合体を調べるために使用できることです。しかし、この方法は銅結合タンパク質についての洞察を提供することができます。また、他の金属塊などの他のシステムにも適用して、タンパク質が細胞株環境における必須でありながら潜在的に有毒な金属イオンの安全な送達をどのように可能にするかを研究することもできます。

まず、銅が酸化するのを防ぐために無酸素環境でサンプルを調製し、APOサンプルを調製し、銅反応サンプルの約1〜2ミリグラムのペプチドを450〜500マイクロリットルの重水素化NMRグレードの溶媒に溶解し、APOペプチドと同量をEQUモル量の金属塩で450〜500に溶解します。マイクロリットルのNMR溶媒は、センターガラス濾過紙または調査中の化合物に適合し、それらを吸収しない他の技術を使用して各溶液をろ過します。これは、均質性に影響を与える金属粒子を除去するために不可欠です。

溶液をNMRチューブに移し、チューブ内のサンプルを閉じます。グローブボックスを出る前に、サンプルをグローブボックスから取り出して密封します。APOと銅反応したサンプルの1次元プロトンスペクトルをNMRマシンで記録し、比較します。

APOペプチドは柔軟性があり、平均して確認されますが、銅と反応すると、結合したペプチドアミドはより硬い構造になります。したがって、銅含有ペプチドスペクトルは、アミド領域の化学シフトに大きな変化を示すはずであり、ピークが分離する可能性があります。テキストプロトコルに記載されているのと同じ条件下で、最適化された居心地の良い毒素、おせっかいな、またはバラ色のNMR実験を設定し、順番に実行します。

各実験の合間に1次元の実験を行い、データ取得全体でサンプル組成が一定に保たれるようにします。テキストプロトコルで説明したようにデータを処理した後、noeaとバラ色のスペクトルに重ね合わせたcozyおよびtoスペクトルのセットを準備します。スペクトル内のすべてのNOEピークを割り当てる。

まず、フィンガープリント領域の毒素シグナルと重なるピークを割り当てます。これにより、Sparky プログラムレコードによる後続のピーク割り当てエントリが容易になるため、割り当てられたピークは H α からアミドへのタンパク質結合値をデダル角に変換します。また、プログラム内からピークを統合し、既知の距離の交互作用を使用してピークを変換することにより、ピークを距離制約に変換します。

ピークが重なっている場合、または自動積分法を使用できない場合は、目視推定によりピークを強い、中程度、弱い、または非常に弱いとラベル付けでき、これらの指定をそれぞれ最大2.5オングストローム、3.5オングストローム、4.5オングストローム、5.5オングストロームまでの距離に変換できます。インポートでは、距離制約とデダル角度を探索のための正しい形式で行います。Exploreは、正準化学幾何学に準拠する構造を見つけるために確認空間を検索します。

実験的に発見された距離制約に加えて、これらのパラメーターのいずれも違反しないアンサンブルを生成します。これがスターティングアンサンブルを構成します。金属に対する制約を使用せずに最初の構造決定実行を実行し、バイアスなしで金属結合に関与する残留物を見つけます。

、000反復のための共役勾配エネルギー最小化を使用して構造を最小化する前に、テキストプロトコルで説明されているように、割り当てだけでなく、NOEエネルギーとシミュレートされたひざまずくパラメータの間違いを特定するために、制約を徐々に導入し、通常50人のメンバーの最終的なアンサンブルを作成します全体のアンサンブルに反復的な方法で制約の導入を行い、NOE相互作用の各タイプの数を報告します。最後に、標準的な化学幾何学と経験的NMR導出制約レポートに準拠する構造のアンサンブルを作成します。確認の総数、NM Rived 制約に違反しているこれらの数、およびアンサンブル全体の RMSD (バックボーンとすべての重原子 RMSD 値の両方を含む)。

低エネルギーアンサンブルを解析し、金属イオンを結合できるように、どの残基側鎖が互いに正しく近接しているかを判断します。これらが決定されたら、銅の結合データを含む分析を繰り返します。NMRから導出された距離制約に加えて、決定された残基に金属結合制約を追加します。

金属イオンとそのトポロジーを説明するための適切なパラメータを追加します。他の原子との質量結合長、角度、非結合反発パラメータなどの適切な物理情報をパラメータファイルに入力します。バインディング情報をトポロジ・ファイルに追加します。

この情報には、どの結合が形成されて切断されるか、および結合の結果としてどの正式な電荷が変更されるかが含まれます。最後に、解かれたアンサンブルがペプチドによって採用された確認空間を表す前と同様に、構造のアンサンブルを取得します。NMR測定中に、構造のすべての確認をMal Mallプログラムにインポートして、開始アンサンブルを作成します。

アンサンブルを調べて、分子の局所的な安定性を判断します。配列に沿って後続の4つの残基領域を選択し、プログラムにRMSDを最小エネルギー構造または平均に計算させることにより、バックボーンと側鎖のRMSD値を決定し、局所的なRMSDを配列の関数としてプロットすることにより、分子のどの領域が局所的な安定性を示すかを決定し、分子のこの領域に沿ってアンサンブルを重ね合わせ、このアンサンブルをさらに分析するために使用します。NMRから導出された制約条件に準拠した低エネルギー確認を選択します。

これらは低エネルギーアンサンブルレコードを形成し、アンサンブル内の確認数、それらを選択するための基準、およびRMSD値を報告します。金属結合モードがまだ決定されていない場合は、低エネルギーアンサンブルを分析し、どの残基側鎖が正しくないかを判断します。金属イオンを結合できるように互いに近接していること。

KYMERAを使用して、金属結合が疑われる原子間の分子内距離を決定します。アンサンブルの平均距離が決定されたら、アンサンブルの平均距離を計算します。銅の結合データを含む解析を繰り返します。

アンサンブルを検査し、MALモールプログラムのデフォルトの検索パラメータを使用して、分子内の局所的な二次構造を決定します。次に、アンサンブルを kymera にインポートします。二次構造は水素結合によって保持され、分子の安定な領域を示します。

kymeraツールを用いて水素結合を判定します。テキストプロトコルに詳述されているように、構造解析を続行します。次に、すべての構造所見を合計して、それらが互いにどのように強化するかを明らかにします銅結合タンパク質モデルを研究するために、誘導された線状ペプチド内のタンパク質の保存結合配列の構造は、溶液状態NMR、ペプチドのアミド領域6.7から8.5によって決定されました。

PP Mは、銅との反応により6.6〜9.0 PP M.Lineの広がりが見られ、わずかな銅の酸化による広がりがベースラインで明らかになりました。ここに示されているのは、Roy Toxiのフィンガープリント領域と銅結合ペプチドのコージースペクトルのオーバーレイです。サンプルは時間とともに安定しており、スペクトルはよく分解され、バラ色の実験によって取得された81のNOE相互作用が得られました。

NO C実験では分子がNOE相互作用をほぼゼロにしたため、反応したサンプルに由来するペプチドのアンサンブルは、金属への制約を使用しないため、50の非構造のうち47が得られ、バックボーンと重原子のRMSD値はそれぞれ1.44オングストロームと2.07オングストロームでした。これらの13の低エネルギー配座異性体をさらなる分析のために選択し、バックボーンと重原子のRMSD値をそれぞれ0.25オングストロームと0.61オングストロームにしました。局所的なRMSDプロットは、プロレン残基を含む硬質C末端領域に加えて、この領域は、すべての確認で残基4と7の間の曲げ確認に見出される。

曲げ確認は、骨格ドナーとアクセプターグリシン5と3アニン2、システイン6とシステイン3との間の水素結合によって安定化されます。この曲がりは、シスチン3とサイン7でも、この領域の結合値の減少によって明らかです。確認をこの領域に重ね合わせ、シスチン3、シスチン6、およびメチオニン1を潜在的な結合残基として考慮した場合に、結合残基の可能性について分析しました。

硫黄原子間の最短距離は、システイン3とシステイン6の葉酸グループ間で、銅結合が導入され、計算が繰り返されて分析に使用されるアンサンブルが得られました。銅結合ペプチドの低エネルギーアンサンブルは、末端アミンが結合した銅に近接していることを示しています。ここに示されているのは、青で示された正電位と赤で示された負電位の静電位分布等値

アルギニン残基はペプチドのバックボーンから伸びて静電ポテンシャルの正ローブを形成しますが、バックボーンの炭素収率はあまり目立たない負の静電ポテンシャルを形成するラインに配置されています。習得すると、構造分析に使用できる確認のアンサンブルを得るために、約1週間のNMR時間とさらに数日間の精密検査で構造決定を行うことができます。この手順に続いて、他のペプチド変異体および異なる条件を分析して、銅イオンのさまざまな程度の結合および放出に必要な条件に対処する追加の質問に答えることができます。