マウス抵抗動脈から毛細血管内皮の管の隔離
2013年11月25日
我々は、ネイティブ、そのまま微小血管内皮にカルシウムシグナル伝達を可視化して操作するための準備を提示する。内皮チューブは新鮮に、骨格筋、隣接セル内との間で、生体内の形態および動的なシグナリングに保持供給マウス抵抗動脈から単離した。内皮チューブは、他の組織および器官の微小血管から調製することができる。
この手順の全体的な目標は、マウスの上腹部動脈またはSEAから内皮細胞管を分離して、ネイティブの無傷の微小血管内皮の細胞内および細胞間シグナル伝達ダイナミクスを研究することです。これは、最初にマウスの腹部骨格筋壁からSEAを分離することによって達成されます。第2ステップでは、血管を穏やかかつ体細胞的に消化し、次に慎重にTATして、平滑筋細胞と外膜を内皮細胞管から解離させます。
最終ステップでは、チューブをフローチャンバーに固定し、生理食塩水と超融合します。最終的には、共焦点イメージングを使用して、ネイティブの無傷の微小血管内皮チューブ内のカルシウムシグナル伝達を視覚化できます。内皮細胞の培養のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、チューブを構成し、それらの本来の形態、タンパク質発現、および応答性を維持する内皮細胞が、体全体の血流制御に不可欠であることです。
この技術を応用することで、血流制御を媒介する細胞間シグナル伝達イベントと、血管機能障害時にそれらがどのように異常になるかを調査することができます。SEAを分離するには、まず、麻酔をかけたマウスの恥骨領域のすぐ上の皮膚から小さな切開を行い、切開部を各方向に横方向にそれぞれの後肢に伸ばし、次に腹側正中線に沿って胸郭の上部まで切開を続けます。次に、皮膚をそっと持ち上げ、皮膚を下にある筋肉に固定している結合組織を切断し、腹部の筋肉組織の表面全体を露出させます。
露出した筋肉を室温の生理食塩水で洗浄します。次に、実体顕微鏡で、胸骨の下部にある脂肪パッドを持ち上げます。脂肪パッドから下部の肋骨に沿って切開します。
SEAは、動脈を損傷しないように注意しながら、露出した組織をより室温の生理食塩水で洗浄するように注意しながら、見えるはずです。骨格筋の最上層が引っ込められた後、SEAの長さに注意し、動脈の下の細い筋肉層を慎重に切除します。次に、角度のついた鉗子を使用して、SCAの下に6つの絹の縫合糸を通します。
次に、動脈とその隣接する静脈を結紮して、動脈を加圧し、血液を血管内腔内に保持します。反対側でSCAを結紮した後、腹筋の正中線に沿って切開してそれぞれの側を分離し、皮膚の場合と同様に切開を各方向に横方向に伸ばします。外縁に沿って垂直に切開を続け、腹部の筋肉を体から完全に分離します。
次に、結紮の上でSEAを切断してシールを維持し、分離された筋肉と動脈を摂氏4度の解剖緩衝液10ミリリットルを含む50ミリリットルのビーカーに入れます。腹部の反対側から筋肉を分離した後、解剖バッファーで組織を10分間インキュベートします。次に、SEAを含む腹筋を、cyl guardの層でコーティングされ、解剖緩衝液を含む摂氏4度のシャーレに置きます 0.15ミリメートルの昆虫ピンを使用して、SEAと筋肉を以前にメモしたおおよそのin vivoの長さに伸ばします。
SEAをcyl guardに固定し、腹膜に面する薄い層が上になるように筋肉を向けます。次に、ライゲーションの上流部位から下流端に向かって、SEAの約1〜2センチメートルを、その対になった静脈と周囲の組織から最初の主要な分岐部位までクリアします。SEAを分岐部位のすぐ上、結紮のすぐ下で切断します。
次に、伸縮性チューブを使用して、ピペットの後端を氷冷解剖バッファーを含む5ミリリットルのシリンジに取り付けます。カニューレピペットの先端を解剖チャンバー内に固定し、SEAをカニューレします。次に、すべての赤血球が洗い流されたら、カニューレ挿入ピペットからSEAを取り出し、解剖皿からピペットを取り外して内皮チューブを分離します。
まず、12 x 75 mm のガラス製培養チューブに氷冷解剖バッファーを半分まで満たします。次に、SEAを1〜3ミリメートルの断片に切断した後、角度のついた鉗子を使用して動脈片を培養チューブに移し、チューブを氷の上に置きます。次に、消化酵素と解離バッファーを12×75mmの別の培養チューブで最終容量1ミリリットルまで組み合わせ、加熱ブロックで酵素溶液を摂氏37度に予熱します。
動脈片が入った培養チューブを摂氏4度から取り出し、酵素溶液が摂氏37度に温まっている間に室温で温めます。室温になった解剖バッファーを培養チューブから慎重に吸引し、容器セグメントを含む少量を残します。次に、室温の酵素を含まない解離バッファーを血管セグメントにゆっくりと追加し、動脈片が培養チューブの底に残るようにして、残りの解剖バッファーを洗い流します。
酵素溶液が摂氏37度に達したら、容器セグメントを含む培養チューブから解離バッファーを再度吸引し、容器セグメントを含む少量を残します。次に、37°Cの酵素溶液を培養チューブに移し、培養チューブを加熱ブロック内で37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション中に、鉱物油を埋め戻したリテラシエーションピペットを準備し、ピペットにスコアリングを入れ、きれいに休憩し、鉗子の火でピペットを壊し、ピペットの先端を磨き、マイクロマニピュレーターに取り付けられたマイクロシリンジに固定します。
次に、マイクロシリンジプランジャーを引っ込めてピペットに2ナノリットルの解離バッファーを充填し、インキュベーション終了時のフローチャンバー上にピペットチップを配置します。示したように緩衝液を慎重に吸引した後、動脈セグメントを4ミリリットルの室温解離緩衝液で洗浄します。次に、1ミリリットルのマイクロピペットで1つの容器セグメントを穏やかに吸引し、1ミリリットルの解離バッファーを入れたフローチャンバーに容器を入れます。
テーテーションピペットの先端を血管セグメントの一端近くに配置し、次いで血管セグメントを毎秒約225ナノリットルでテーティングピペットに吸引し、内皮細胞に機械的負担を引き起こさないように、容器をチャンバー内に排出する。消化が成功した場合、平滑筋細胞と外膜は内皮管から解離します。できるだけ早く内皮チューブから外膜を離してチューブが絡まないようにし、次に、すべての平滑筋細胞が解離するまで、先ほど示したように繰り返します。
最終反復後、ASEE と分離された内皮チューブをフローチャンバーの中央に配置し、フローの方向に沿って位置合わせし、トリガーピペットを取り外しました。フローチャンバーの両端に取り付けられたマイクロマニピュレーターにピン留めピペットを固定し、その先端を内皮チューブのそれぞれの端に配置します。ピン留めピペットをチューブの両端に一度に1つずつ下げ、チューブの両端から約50マイクロメートルのチャンバーの底部にチューブを押し付けます。
ピン留めピペットがチューブに触れると同時に、チューブの軸に沿ってゆっくりと引っ込め、おおよそのin vivoの長さまで伸ばします。ピペットをチャンバー底部に押し付けてチューブを固定し、蠕動ポンプを使用して超融合溶液の流れを開始し、内皮チューブを横切る超融合溶液の流れを一定に保ちます。この微分干渉コントラスト画像では、SEAから単離された内皮細胞チューブに続いて、室温で毎分3ミリリットルの超融合バッファーを用いた1時間の超融合が示されています。
この動画は、1マイクロモルのアセチルコリン刺激に応答して、インフルエンザoh 4負荷内皮細胞チューブのカルシウム応答を示しています。これらの代表的な蛍光画像は、アセチルコリンによる内皮チューブ刺激後のさまざまな時点で収集されました。細胞内カルシウムが時間の経過とともにどのように振動するかに注意してください。
この手順を試みる際には、内皮細胞が非常にデリケートで損傷しやすいため、トライポジショニングとピン留め中に内皮チューブを機械的に損傷しないように注意することが重要です。このビデオを見た後、マウスの上腹部動脈から内皮チューブを分離する方法、およびそれによってネイティブの無傷の微小血管内皮を研究する方法についてよく理解できるはずです。
概要
本記事では、生体内の微小血管内皮におけるカルシウムシグナリングを可視化し、操作するための手法を紹介します。この手法では、マウスの抵抗動脈から内皮管を単離させますが、これによりin vivoでの形態および動的なシグナリング能が維持されます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 血管生物学
背景
- 血管内皮は血流の調節において重要な役割を果たしています。
- 血管内皮細胞におけるカルシウムシグナリングを理解することは、血管機能を研究する上で不可欠です。
- 従来の手法では細胞培養が行われることが多いですが、これにより細胞本来の特性が変化する可能性があります。
- 本手法を用いることで、細胞を本来の環境下で研究することが可能になります。
研究目的
- 細胞内および細胞間シグナリングダイナミクスを研究するために、内皮細胞管を単離する。
- 内皮細胞の本来の形態と応答性を維持する。
- 血流を制御するシグナリングイベントと、それが血管機能不全に及ぼす影響を調査する。
使用した手法
- マウスの腹部骨格筋から上腹壁動脈を単離する。
- 血管を緩やかに消化し、内皮管から平滑筋細胞を解離させる。
- イメージングのためにフローチャンバー内に管を固定する。
- 共焦点イメージングを用いてカルシウムシグナリングを可視化する。
主な結果
- in vivoでの特性を保持した血管内皮管の分離に成功。
- 無傷の微小血管内皮におけるカルシウムシグナリングダイナミクスの可視化。
- 従来の細胞培養法に対する本手法の優位性の実証。
- 血流を調節するシグナリングメカニズムに関する知見の獲得。
結論
- この手法は、血管内皮細胞のシグナル伝達を研究するための強力なツールとなります。
- これにより、血管の機能および機能不全に関する理解が深まります。
- このアプローチを他の組織や臓器に適用することで、より広範な研究への応用が可能です。
よくある質問
産業界における重要性
完全な形態の微小血管内皮管を単離することで、平滑筋や血液成分による混入の影響を受けることなく、本来のカルシウムシグナリングダイナミクスを直接的に研究することが可能になります。このアプローチは、ギャップ結合を介した生理学的な細胞間相互作用を維持するため、血管生物学におけるターゲットバリデーションを支援します。本手法は、内皮機能および血流調節に影響を与える化合物のメカニズム的なリスク低減（de-risking）に向けた、疾患に関連するシステムを提供します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 生体内の内皮形態とタンパク質発現を維持することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： ギャップ junction を介した細胞間シグナル伝達を保持し、機能的なターゲットバリデーションを可能にする。
- 予測的価値： 内皮特異的なカルシウムシグナル伝達経路を単離することで、メカニズム的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備： 超灌流チャンバー内での定量的なフラックス測定用に、標準化された血管内皮管を調製します。
- 再現性： アセチルコリンなどの作動薬に対する天然の反応性を維持した、一貫性のある調製物を生成します。
- 拡張性： カルシウム依存性血管拡張経路に影響を与える化合物のスクリーニングに向けた、プラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：組織灌流制御に不可欠な抵抗動脈の微小血管内皮をモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性：本来のシグナル伝達構造を維持することで、基礎研究から前臨床検証への橋渡しを可能にします。
- リスク調整後の進展：内皮特異的な作用機序に基づいた、開発継続（go/no-go）の判断基準を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット仮説の検証からリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、フェノタイプスクリーニングキャンペーンに先駆けて、血管内皮細胞特異的な機能的リードアウトを提供します。
- 探索生物学：無傷の微小血管ネットワークにおけるカルシウムシグナリング動態を単離することで、パスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：化合物の評価に向け、定量可能なフラックス出力を備えたアッセイ準備済み試料を提供します。
- 分析：パスウェイ調節の機能的リードアウトとして、細胞内カルシウム振動の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：天然の内皮組織の特性を維持することで、探索段階から前臨床段階までの連続性を確保します。
- エンタープライズ再利用：さまざまな血管床における内皮機能不全を研究するための、再利用可能な能力を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：天然の内皮シグナル伝達を維持することで、ターゲットバリデーションにおける予測的信頼性を向上させる。
- 運用の価値：実験間における内皮管調製の標準化と再現性を確保する。
- 戦略的価値：内皮メカニズムの不確実性を早期に排除することで、後期段階における生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響：血管緊張調節を標的とする化合物のリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 微小血管の解剖および酵素による組織調製の専門知識が必要です。
- 機能的読み取りには、灌流チャンバーおよびカルシウムイメージングシステムが必要です。
- 血管の単離および平滑筋の解離には、標準化されたプロトコルが必要です。
- 適応上の検討事項として、モデルや種による血管径の変動が挙げられます。
- 実用上の制限として、取り扱い時や灌流セットアップ時における内皮管の脆弱性が挙げられます。
