熱誘導抗原賦活化:成体海馬神経新生における前駆細胞型の検出および同定に有効な方法

この手順の全体的な目標は、海馬の脳組織で抗原賦活化を行い、新生児ニューロンを生じさせる前駆細胞の種類をよりよく視覚化することです。これは、まずマウスから灌流された脳を採取し、薄い冠状切片を切断し、これらの切片を組織に強く接着するように特別に設計されたスライドガラスに取り付けることによって達成されます。2番目のステップは、スライドをティッシュとKayアトピー処理で沸騰させ、冷却に十分な時間を確保することです。

次に、一次抗体で組織を一晩染色します。最後のステップは、翌日に組織に対して少なくとも2時間にわたって二次抗体染色を行うことです。最終的には、タイムラプス顕微鏡または共焦点顕微鏡法を使用して、海馬組織の成体ニューロン新生中のさまざまな発達段階にわたるさまざまなプロジェンダー細胞タイプを視覚化します。

こんにちは、私の名前はフン・ジョー、ポスドクで、イアン・ジョン博士の研究室とメイヨークリニックのメンバーです。ジョン研究室では、神経疾患や精神疾患における他の神経新生の過程を研究することに主眼を置いています。私たちの最終目標は、そのような知識を治療応用に成功裏に翻訳し、抗原レトリーバーの手順がQuam Huiであり、私たちの研究室のこんにちはJohnであることを示すことです。

既存の免疫組織化学の方法に対する私たちの技術の主な利点は、成体海馬の神経新生中に異なる細胞タイプを効果的に視覚化できることです。これらの細胞タイプには、他の方法では検出が困難な前駆神経幹細胞も含まれますが、当社の抗原賦活化法を用いて効率的に標識し、可視化することができます。この方法は、成体海馬ニューロン新生中の新生児ニューロンの発達と制御に関する洞察を提供します。

精神障害や薬物療法の研究に興味がある方にとって、私たちの抗原検索は、この疾患における神経細胞の発達の役割を調査するのに役立つことが証明されます。病因。灌流マウスの脳を4%パラホルムアルデヒドに10ミリリットルの円錐管に入れ、摂氏4度で一晩、または少なくとも12〜24時間、ただし完全に固定するには36時間以内に置くことから手順を開始します。一晩固定した後、PFAを除去し、脳を円錐管に残します。

次に、30%のスクロースで脳をすすぎ、残留PFAを取り除き、スクロースを廃棄します。次に、チューブに再び30%のスクロースを入れ、脳がチューブの底に沈むまで摂氏4度に保ちます。その後、ミクロトーム上で海馬を40マイクロメートルの脳切片に切り取ります。

不凍液中の切片を免疫組織化学の準備ができるまで保存します。次に、組織に強く接着するように特別に設計された顕微鏡スライドにスライスを取り付けます。ティッシュを取り付けた後、スライドを約10分間乾かします。

スライドをペーパータオルの垂直面に当てて、以前の化学物質を完全に除去すると、乾燥を早めることができます。スライドが乾いたら、PB S3で毎回5分間洗浄します。その後、再び乾かします。

この手順では、添付の原稿に記載されている手順に従って、組織沸騰用の溶液を調製します。次に、溶液を標準設定の標準電子レンジで5分間沸騰させます。沸騰が完了したら、容器を電子レンジから慎重に取り出します。

その後、乾燥させたスライドを溶液に移します。海馬の部分がある側が溶液に完全に露出していることを確認してください。可能であれば、スライドをコンテナの壁に対して斜めに置き、その周りに他のスライドを積み重ねます。

次に、スライドと混合物を電子レンジで標準設定で7分間沸騰させます。その間に、2つの氷のバケツを半分氷で満たします。沸騰が完了したら、容器を電子レンジから取り出し、アイスバケツの1つに入れます。

もう一方のバケツから残りの氷を容器全体に注ぎ、完全に覆います。その後、1時間後に1時間放置します。スライドをコンテナから取り出します。

TBSTバッファーで毎回5分間、3回洗浄します。次に、スライドを暗所で5〜10分間、またはスライドが完全に乾くまで乾かします。その間に、DDH two Oを添加したチャンバーを調製し、一晩の一次抗体染色を行います。

スライドが乾いたら、水上告人ペンを使用して組織切片の周りに輪郭を描きます。このアウトラインは、抗体混合物が流れ込むのを防ぐバリアとして機能します。次に、一次抗体混合物をT-B-S-T-Tで調製します。

乾燥させたスライドを染色チャンバーのステージに置きます。一次抗体を500マイクロリットルゆっくりと加えて、表面全体を覆います。その後、染色チャンバーを覆って外光を遮断し、翌日は室温で一晩保管し、スライドをTBSTバッファーで毎回5分間3回洗浄します。

その後、暗闇で乾かします。次に、T-B-S-T-Tで二次抗体混合物を調製します。次に、ドライスライドを染色チャンバーに入れます。

500マイクロリットルの二次抗体を添加します。二次染色終了後、染色チャンバーをゆっくりと覆い、室温で少なくとも2時間外光から離さないようにし、スライドをTBSTバッファーで毎回5分間3回洗浄し、乾燥後はスライドを暗所で乾燥させます。スライドに取り付けソリューションを追加します。

気泡が入らないように、カバースリップで丁寧に覆ってください。次に、スライドを少なくとも2時間暗く保ち、その後の分析を行い、染色された組織でタイムラプスまたはコンボ分析を実行します。成体海馬のニューロン新生は、歯状回の顆粒下ゾーン全体に描かれています。

活性化された放射状グリアのような1型幹細胞は、分化し、成熟し、神経回路への精巧な形態で機能的に統合されるときに、異なる段階を経ます。各相およびそれぞれの細胞型は、マーカーの組み合わせの発現に基づいて同定することができる。MCM 2は、すべての有糸分裂前駆細胞タイプに発現する増殖マーカーであり、neinは放射状および非放射状グリア様幹細胞に発現します。

タイプ2のA前駆細胞が分化するため、ネストされた発現は最初にオフになります。抗TBRの2つの発現は、有糸分裂後の前駆細胞での2つの発現の増加、MCMの2つの発現は失われますが、DCXおよびNEWANの発現は、機能的なニューロンへの移動と成熟を指示します。パープルMCM、2グリーンネストン、レッドダッピー染色の代表的な共焦点画像です。

ボックス内の拡大画像は、neston MCM twoとdpiを発現する放射状GLのような前駆体を示しています。これは、青、MCM、2、赤、TBR、2、緑、DCX、および灰色のdpiの代表的な共焦点画像です。タイプ2のB前駆細胞タイプの特性を染色することは、MCM two、TBR 2D、c、X、およびdpiを発現するボックス内の拡大画像に示されています。

この手順を試みる際には、3つのことを覚えておくことが重要です。1つは、右の冠状の厚さのよく灌流され、固定されたティッシュを利用します。2つ目は、ティッシュをスライドに平らに取り付け、その際の損傷を防ぐことです。

そして最後に、3つは、抗原賦活化中の沸騰とその後の冷却に十分な時間を確保します。この手順に続いて、共焦点組織の再構築や行動実験などの他の方法を実行して、新生児のニューロンが海馬回路にどのように統合され、認知機能に寄与するかに関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、海馬組織で抗原レトリーバーを実行する方法がよく理解でき、他の海馬神経症中に新しいニューロンを生じさせる提示的な細胞タイプをより効果的に視覚化することができます。