デザイナーヌクレアーゼを用いてマウスゲノムエンジニアリング

この手順の全体的な目標は、デザイナーテールヌクレアーゼまたはタロンの助けを借りて、遺伝子欠損マウスを迅速に作製することです。これは、まず、特定のTalonペアをコードするDNAコンストラクトを設計し、組み立てることによって達成されます。このコンストラクトは、Talon mRNAを生成するためのin vitro転写のテンプレートとして機能します。手順の次のステップは、受精したマウス細胞を分離し、次にT.Theでそれらをマイクロ注入することです。

結果として得られるFゼロの子孫は、ゲノム配列の部位特異的な欠失を頻繁に示し、しばしば標的遺伝子機能の喪失につながります。ここで紹介した方法は、マウスの遺伝子機能に関する洞察を提供しますが、基本的なアプローチは、ラットや魚などの他のモデル生物にも適用できます。まず、TALエフェクターヌクレオチドターゲターのサイトにアクセスします。

TNターゲティングプログラムを選択し、標的遺伝子の配列に貼り付けます。このプロトコルの場合。ad geneで利用可能なP-C-A-G-T 7つのTALEN発現コンストラクトとゴールデンゲートTalenおよびTエフェクターキットを使用してください。

タレン アセンブリ設定に他のコンストラクトまたはアセンブリ キットが使用されている場合、最適なスペーサーの長さとテール RV の数が異なる場合は、[プリセット アーキテクチャを使用する] 設定で [Miller Etal 2011] オプションを選択します。次に、[G置換]タブで[NN]を選択します。プログラムは、このリストから生成された潜在的なターゲットサイトを含むテキストファイルを生成します。

必要なタレンペアを選択し、ゴールデンゲートアセンブリを続行します。このプロトコルは、5単位の妊娠牝馬血清ゴナドトロピンの腹腔内注射を使用して、4週齢で10人のドナー雌にC 57 BL six JおよびBDF oneスーパー排卵するなど、最も一般的に使用される実験用マウス株で機能します。48時間後に、ヒト絨毛性ゴナドトロピン注射の直後に腹腔内注射によっても女性に5単位のヒト絨毛性ゴナドトロピンを与え、女性は同じ日に繁殖年齢の男性と1対1で、疑似妊娠した里親を準備します。余人。

翌朝、雌を犠牲にし、uctsを解剖して受精した卵子を回復します。次に、卵子のクラッチをミリリットルのM 2培地を含む臓器培養皿に放出します。M二培地中の細胞クラッチを含む皿に10マイクロリットルの0.1%ウシヒアルロニダーゼ溶液を加えて、すべての卵丘細胞を除去する。

次に、マウスピペットを使用して、ヒアルロニダーゼを除去するためにM two mediumを2、3回交換して胚を洗浄します。まだ卵丘細胞から解離していない胚に対するヒアルロニダーゼ治療を継続する。単離された胚は、マイクロインジェクションされるまで、摂氏37度と5%の二酸化炭素で培地であるM16に保存できます。

各尾のマイクロリットルあたり10ナノグラムを含む100マイクロリットルの注射液を準備します。ヌクレアーゼ、mRNA、ペア、および30, 000 Gで30分間遠心分離し、ペレット化します。注射針を詰まらせる可能性のある粒子。

次に、ミックスを氷の上に保ちます。午後の早い時間に卵子を前核段階で注入することを計画してください。約100個の胚をM2培地に鉱物油の層の下に沈め、マーシーDIC光学系のない倒立顕微鏡で作業します。

20倍の拡大で、前核がはっきりしている細胞を選択します。卵子の選別は、空の注入毛細管負荷を使用して行うことができ、注入毛細血管は、注射液の1〜2マイクロリットルで使用される直前に行われます。その後、マイクロインジェクションヘッドに取り付けます。

次に、選択した細胞を保持毛細血管で吸引し、ヌクレアーゼmRNAを細胞質に浅く注入します。前核との接触を避けてください。注入量は低く抑える必要があります。.

細胞質膨張の最初の兆候で、針を引き抜きます。通常、胚の約80〜90%はすぐに生き残るはずです。注入されるmRNAの量を増やすには、利用可能な細胞のマイクロインジェクション後に溶液をより濃縮します。

マウスピペットを使用してM 16培地に移します。胚を摂氏37度と二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。次に、生き残ったものを偽の妊娠中の里親に移します。

マイクロインジェクションの前日、生後3〜6か月のCDで1匹の雌マウスをVAsセクター化されたオスと交配することにより、偽妊娠を誘発します。翌朝、透明な栄養栓を持つ雌を選択し、胚のレシピエントとして使用します。未使用の女性は3週間で疑似妊娠状態に戻り、その後再利用できます。

麻酔をかけた里親の女性を腹部の暖かい表面に置きます。次に、切開部に70%エタノールを噴霧して消毒します。濡れた髪を計画された切開部位から遠ざけます。

次に、ハサミで腹腔を切り開き、子宮角を外部化します。これを行うには。卵巣に取り付けられている脂肪パッドを引っ張り、ブルドッグクランプで生殖器官を固定します。

また、温めた0.9%塩化ナトリウム溶液で臓器を湿らせてください。この時点で、12〜20個の生存可能な胚を選別し、薄いガラスキャピラリーにロードします。マウスピペットを使用して、最初に小さな気泡を吸引し、次に細い鉗子を使用して胚を吸引します。

アンプのすぐ上流でUCTをそっとつかみ、30ゲージの針を使用してUCTの壁に小さな穴を開けます。ロードしたキャピラリーを穴に挿入し、気泡がキャピラリーから移動したことを確認するまで、胚をアンプにそっと吹き出します。次に、キャピラリーを取り外します。

すぐに生殖器官を体腔に戻し、1回の縫合糸で腹腔を閉じます。次に、9mmの巻き付きクリップを1つまたは2つ使用して皮膚を閉じます。動物を自宅のケージに戻し、麻酔が切れるまで彼女を監督します。

その後、術後最初の3日間のストレスを最小限に抑えるために、2〜3匹のマウスの安定した社会グループに女性を収容し、デザイナーヌクレアーゼの対象となるマウスゲノムのすべてのイナゴの飲料水にDEFファルコンのような鎮痛剤を提供することを確認してください。PCRベースのアッセイは、目的の変異対立遺伝子を持つ創始動物を特定するように設計されています。最初の例では、創始者はテールヌクレアーゼペアのマイクロインジェクションに由来します。

マウスプリオンタンパク質遺伝子のコーティング領域を標的として、PCR産物のT sevenエンドヌクレアーゼ消化法により解析した。T seven Endonuclease消化アッセイは、変異型および野生型対立遺伝子から生成されたPCR産物のDNA鎖間のヘテロ二本鎖の形成に依存しています。Talonは、完全長PCR産物に加えて、250塩基と110塩基のペアの長鎖消化産物の出現により、単一創始者の標的ゲノム領域内での突然変異誘発を明らかにしました。

あるいは、適切な診断制限部位がデザイナーヌクレアーゼペアのスペーサー領域内に位置している場合、PCR産物を制限消化物に供することができる。2 番目の例では、ZFN は、イントロ内にある XPO 1 制限サイト、マウス Rosa 26 遺伝子座の 1 つを対象とします。ここで、未消化のバンドは突然変異の存在を示しています。

アスタリスクマークは、消化された製品がないことを示しており、標的遺伝子の両方の対立遺伝子に突然変異を持つ創設者を強く示唆しています。これらの未消化PCR産物のクローニングとシーケンシングにより、創始マウスは標的対立遺伝子の2つ以上の異なる修飾を保有できることが明らかになりました。野生型配列が存在しないことは、標的遺伝子が完全にアブレーションされていることを示しています。

このビデオを見れば、テールヌクレアーゼの設計、テールの組み立て、ヌクレアーゼコンストラクト、およびこれらを使用して直接オシドマイクロインジェクションによる変異マウスの生成方法についてよく理解できるはずです。この方法は、亜鉛、指核、CAS nine CRISPRなど、他のクラスのデザイナーヌクレアーゼと併用するように適応させることができます。また、ヌクレアーゼと適切な遺伝子ターゲティングテンプレートの同時挿入による相同組換えによるゲノム改変を促進することもできます。