人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

この手順は、多孔質膜の反対側にあるアストロサイトと内皮細胞を共培養することにより、血液脳関門のin vitroシミュレーションを目指しています。まず、多孔質膜の管腔表面を細胞外マトリックスでコーティングします。コラーゲンのようなタンパク質は、外側のシリコンチューブと内側のシリコンプラグを反転インサートにフィットさせ、膜のアブルミナル表面上に取り外し可能なウェルを作成します。

次に、逆インサートに星状細胞を播種して、アストロサイト細胞が管腔表面に付着するようにします。次に、チューブを取り外し、インサートを通常の向きで培地で満たされたウェル内に配置します。次に、内皮細胞をインサートの管腔コンパートメントに播種し、対向するアストロサイトと共培養します。

最終的に、蛍光トレーサーの通過または経内皮電気抵抗の記録は、さまざまな刺激剤に応答したin vitro BBBの透過性変化を測定するために使用されます。この手順を実証するのは、私の研究室のポスドクであるバリー・ニゴ氏で、博士課程のコース中に、血液脳関門をシミュレートするために使用したこの修正された播種プロトコルを開発しました。私たちが最初にこの手順のアイデアを得たのは、より粗雑な座席方法をテストし、一時停止による媒体の漏れや少量の中量に多くのフラストレーションを感じた後でした。

これにより、アストロサイトの着座期間が短くて不十分になり、私たちはこの手術でこれに取り組もうとしています。組織培養インサートを24ウェルプレートのウェルに入れます。次に、1ミリリットルあたり132マイクログラムのラットコラーゲンを50マイクロリットル加え、1つはインサートの管腔表面をコーティングし、加湿した摂氏37度のインキュベーターで一晩インキュベートして残留酸を除去し、インサートの管腔側と管腔側の両方を二重蒸留水で洗浄します。

次に、インサートを反転させ、多孔質膜の縁の周りに短い弾性シリコンチューブをそっと取り付けます。基本的には、光面の上に新しい井戸を作成します。下面をシールします。

0.2ミリリットルのPCRチューブの先端をカットした先端で一端を密封したシリコンチューブ製のプラグを用意します。次に、滅菌鉗子を使用して、シリコンプラグを管腔に挿入し、膜から約1〜2ミリメートルに達するまで進めます。次に、40, 000の星状細胞を200マイクロリットルのメンテナンス培地に直接、管膜表面の上のシリコーンに直接注入します。

アストロサイトの接着状態をモニタリングするには、6.5mmインサートと同じ表面積を持ち、許容される標準の96ウェルプレートを使用します。位相差顕微鏡による細胞の可視化が容易なシードは、96ウェルプレート8に同一量のアストロサイト細胞懸濁液である。これは、96ウェル内、ひいてはインサートメンブレン内のアストロサイトが無菌性を維持するのに十分な接着性を持つかどうかを判断するために、経時的に監視されます。

組み立てたインサートを2つの6ウェルプレートの間に輸送して、ろ過されていない空気への曝露を最小限に抑えます。細胞をインキュベーターに入れて、アストロサイトが接着できるようにします。また、このとき、コントロール96ウェルプレートをインキュベーターに入れます。

約4時間後、アストロサイトが付着しているかどうかを確認するために、コントロール96をよくチェックします。その場合は、インサートアセンブリを組織培養フードに戻します。外部シリコンチューブとプラグをそっと取り外します。

次に、インサートを通常の直立した向きに戻し、ウェルあたり800マイクロリットルの内皮細胞維持培地を含むウェルに入れます。コラーゲン被覆管腔表面共培養液に200マイクロリットルの20, 000個の脳内皮細胞を、培地を変更せずにBEC培地で3日間共培養します。実験前。

シリコンチューブとプラグを洗ってエタノールを入れてから、後で使用するためにオートクレーブします。in vitro血液ブレインを刺激するために、まず、アブルミナルメディアとルミナルメディアをそれぞれ600マイクロリットルと100マイクロリットルの無血清ベクス培地に交換します。管腔洗浄液を吸引し、刺激剤を含む100マイクロリットルの無血清培地と交換します。.

アストロサイトコンパートメントからin vitro BBBを誘導する場合は、管腔培地を吸引し、600マイクロリットルの無血清と交換します。.刺激剤を含有する培地は、ヒト接触血液脳関門モデルを確立するために、標識トレーサーの標準的な傍細胞または経細胞透過性アッセイを続けます。ヒトの不死化アストロサイトと脳内皮細胞は、アストロサイトと足が内皮細胞と接触するための通過を可能にする3ミクロンの多孔質膜で培養されます。

この方法により、アストロサイトとベックの最適な中断のない播種期間が可能になり、アストロサイトとベックは最小限の細胞損失で多孔質表面に強く付着し、3日で同時流暢に成長します。シード後。どちらの細胞タイプも、SVGおよびvon Vand因子VWF NECにおけるグリア線維性酸性タンパク質GFAPの発現パターンで示されるように、多孔質膜上に細胞特異的マーカーを維持します。

コンタクトBBBモデルの最も基本的な特徴と一致するように、アストロサイトNFEは3ミクロンの細孔を通過して管腔コンパートメントに入ることができます。したがって、この次元の細孔に座っているSVGとBESとの間に接触が存在する可能性があります。さらに、SEMイメージングは、SVGおよびBBCが膜細孔上に直接成長する能力があり、この現象がin vitro BBB接触モデルの物理的バリア機能に人為的に寄与していることを示しています。

この研究では、ヒト接触BBBモデルを使用して、TPAA線維素溶解剤がBBBに及ぼす影響を調査します。これらのin vitro試験では、TPAが実際に無傷のBBBの透過性を濃度および時間依存的に増加させたことが確認されており、これらはどちらも薬理学的に関連する範囲内にありました。TPAへの曝露後の多孔質膜では、SVGアストロサイトの劇的な形態学的変化が明らかであり、TPAに対するアストロサイト反応がTPAによるBBBの開放の根底にあることを示唆しています。

この方法は、脳卒中患者に用いられる血栓溶解薬「TPAA」に対して血液脳関門がどのように反応して血栓を溶解するかを調べることを目的とした私たちの研究において重要な役割を果たしました。これは文献でこの方法の最初のデモンストレーションであり、他の研究者が自分の目的のためにこれを採用できることを願っています。