マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

この手順の全体的な目標は、マウスの新生児から皮質ミクログリアを分離することです。これは、ミューレン新生児から皮質脳組織を解剖する最初のマイクロによって達成されます。第2のステップは、混合グリア細胞培養物をin vitroで17〜21日間増殖させることです。

次に、これらの混合グリア培養物からミクログリアを単離します。最後のステップは、さらなる実験のためにミクログリア細胞を細胞培養プレートにプレートすることです。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法とElizaを使用して、この単離プロトコルがミクログリアの免疫表現型と機能を維持することを示します。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、マイクロマイクロダイセクションに関与するSEPを実行するのが難しいため、非常に重要です。この手順を正常に実行するには、速度と精度の両方が必要です。つまり、遅すぎると細胞収量が減少し、髄膜の不完全な除去はグリア培養物を汚染し、グリアの成長を妨げます。

まず、ミクログリア完全培地(以下、MCMと呼ぶ)を準備します。子犬1匹につき1つのフラスコを準備し、少なくとも1時間インキュベートします。この平衡化ステップは、成功に不可欠です。

次に、アリコートを準備し、氷の上で冷やします。必要なすべての培地は、各子犬に6ミリリットルのMCMを分注し、解剖前に摂氏37度の水浴で温めます。水平エアフローワークステーションと解剖顕微鏡を70%エタノールで拭き取ります。

次に、手術に必要な滅菌済みの手術器具を作業エリアに置きます。頭部を捕捉するための解剖媒体と解剖用の別の培地を含む滅菌皿を準備します。脳組織をミンチするために、ミンチメディアを専用の皿に分配します。

斬首と脳の抽出後、新たに分離された脳を解剖顕微鏡の下に置き、礼儀を視覚化し、背側を上にして乾いた状態に保つようにします。鉗子の先端を中脳と皮質の交点に挿入して脳を固定します。所定の位置に配置されたら、背側皮質髄膜を完全に取り除きます。

次に、腹側髄膜を切除して、ミクログリアの純度と収量を最大化します。すべての髄膜組織を完全に除去することが不可欠です。皮質を脳の残りの部分から分離します。

皮質の腹側または内側に存在する可能性のある残留皮質髄膜を必ず取り除いてください。髄膜組織を取り除いた状態で、皮質を前に準備したミンチ皿に入れます。クラス2の生物学的安全キャビネットで作業し、ハサミを使用して脳組織をミンチします。

ミンチ組織を15ミリメートルの円錐形チューブに移します。はさみとミンチ皿の両方をそれぞれ1ミリリットルのミンチメディアですすいで、収量を最大化します。これらのリンスを集めて、ミンチ組織を含む15ミリリットルの円錐管に分配します。.

組織懸濁液を1〜2分間乱さずに放置し、ミンチ組織をチューブの底に沈殿させます。この時間の後、沈殿したミンチ組織を乱さないように注意しながら、上清の2ミリリットルを慎重に取り除いて廃棄します。前に温めたMCMの3ミリリットルをミンチ組織に加え、組織を強く試します。

トリーアが完了したときには、識別可能な固形組織は残っていないはずです。同じピペットチップを使用してさらに3ミリリットルのMCMを追加し、チップから残留トリチュレートサンプルを収集します。採取したら、細かく刻んだ組織を遠心分離して細胞をペレット化します。

完了したら、ペレット化された細胞を生物学的安全キャビネットに戻します。上清を慎重に取り除いて捨てます。やさしく蘇生します。

細胞ペレットを2ミリリットルの温かいMCMで懸濁し、次に細胞蘇生懸濁液を以前に調製したフラスコに加えます。細胞を24時間インキュベートします。24時間後、フラスコを手のひらにそっと軽くたたいて、組織の破片を破壊します。

タッピングの前後にセルをチェックして、破片が完全に取り除かれていることを確認します。次に、培地を新しいMCMと交換し、フラスコをインキュベーターに戻します。細胞を毎日チェックして、成長と汚染を監視します。

約17〜21日後、ミクログリア細胞は収穫の準備が整い、細胞の準備ができているかどうかを判断し、逆位相コントラスト顕微鏡でそれらを検査します。ミクログリアは収穫の準備ができています。それらが約40%coの流暢さに達すると、それらは他の上に単層として成長する小さくて明るい球形の細胞として現れます。

分離するために、ミクログリアはフラスコを実験室のベンチに強く叩きます。この攪拌は、ミクログリアの接着特性が低いため、ミクログリアを他のグリア細胞から分離するのに役立ちます。フラスコキャップをパラフォームで密封し、温度制御された非加湿ロータリーシェーカーを使用して混合グリア培養物を5時間回転させます。

この後、ミクログリアがフラスコ表面から浮き上がったことを目視で確認します。倒立位相差顕微鏡を使用すると、ミクログリアは明るい球状の自由浮遊細胞です。フラスコの底に付着するアストロサイトとオリゴデンドロサイトの残留層があります。

次に、ミクログリアを含む上清を滅菌済みの円錐形遠心チューブと口蓋に集めます。レザス。ミクログリアペレットを温かいミクログリア増殖培地に懸濁し、ヘモサイトメータープレートを使用して細胞濃度を測定します。プラスチックまたは滅菌ガラスカバー上の24ウェルプレートフォーマット上の細胞は、24時間後に滑ります。

メディアを新鮮で温かいMGMと交換して、浮遊細胞や破片を取り除きます。このステップは細胞の生存に不可欠であり、休止期のミクログリアを維持するために、ミクログリア細胞は、ミクログリアの純度を評価するためのこの再供給ステップの直後に実験の準備が整います。GFPを内因的に発現するミクログリアに由来する細胞培養物をマクロファージ抗原IBA oneについて染色し、dapiで対比染色しました。

細胞核を可視化するためには、95%以上の細胞がGFP IBA oneとdpiの共局在を示しました。LPSで細胞に負荷をかけた後、ミクログリアは小さなバイ表現型からアメーバ様の形への明確な形態学的変化を採用しました。P 65の免疫植物化学的染色は、正常な条件下ではP 65が細胞質全体にびまん性に局在していることを示しています。

一方、Pam P 65に2時間曝露すると、免疫反応性は細胞核への局在性が劇的にシフトし、単離されたミクログリアが生化学的免疫機能を保持していることが確認されました。炎症誘発性サイトカインTNFアルファの分泌は、PAMまたはLPSへの曝露後に決定されました。このビデオを見た後、最良の結果を得るために、新生児のミラーリングから皮質ミクログリアを分離する方法を十分に理解しているはずです。

無菌技術を維持し、解剖された皮質領域から髄膜組織を完全に除去することが重要です。