イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

この手順では、マウスの網膜組織を使用して、繊細な神経組織を安定させて構造的完全性を維持する方法を示します。免疫組織化学染色のいくつかのステップでは、まず眼を核形成し、角膜を切除し、網膜を強膜から分離します。網膜アイカップを切開して組織を平らにします。

次に、組織の完全性を維持するために、直接操作せずに吸引トランスファーを使用して網膜をリング強制膜に取り付けます。次に、リングをマルチウェルプレートに移して染色します。私たちの結果は、この技術が生きた組織で効果的に使用でき、解剖された網膜を扱う既存の金属と比較して、シナプスタンパク質のイメージングに優れた基質を提供することを示しています。

これらの技術により、最小限の物理的操作で繊細な組織を移植することができます。これにより、歪みや損傷の可能性が減少します。このアイデアを最初に思いついたのは、網膜変性のモデルであるRDマウス1匹のフラットマウント組織から記録する必要があり、このマウスの網膜は、突然変異チーフによって引き起こされる広範な細胞損失のために非常に薄くて壊れやすいものでした。

私たちの研究室のポスドクが私と一緒に手順を実演します。まず、麻酔をかけたマウスの眼を核形成し、眼を酸素化されたヒープ緩衝リンガー溶液に移します。角膜を切除するには、鉗子で眼を輪部に保持し、次にオラセラタに沿って円形の経路を切り取ります。

ボーラス注射や電気生理学的記録のための鉗子でレンズを引き出します。ブレンドされたエッジ鉗子を使用して、できるだけ多くのガラス質を取り除きます。次に、強膜を鉗子でしっかりと保持することにより、アイカップを安定させます。

網膜とアイカップの間に2番目の鉗子のセットを配置します。鉗子を円周の周りでゆっくりと動かします。網膜とアイカップの間の視神経を切断し、ハサミでアイカップを取り外します。

網膜末梢から視神経まで切開します。あるいは、網膜全体を使用する場合は、視神経の半分まで周辺部から切開を行い、ホルダーを短くします。余分な部分を旋盤で取り除きます。

次に、細かいサンドペーパーで粗い表面を磨き落とします。リングの下から足を取り外します。プラスチックピペットの細い先端を切り取ります。

次に、何らかの溶液を含む組織をメンブレンに移します。網膜を広げながら溶液を徐々に取り除き、組織を広げます。次に、神経節細胞を上に向けて網膜を膜に取り付けます。

1ミリリットルの注射器の保持先端を切り取り、ティッシュの真下に置きます。プランジャーを約0.3ミリリットルの体積まで引き戻し、メンブレン内の組織を物理的にメッシュ化します。ホウケイ酸塩キャピラリーピペットを約1メガの抵抗で引っ張ります。

次に、各パッチピペットの先端をそっと折ります。次に、ヒープバッファードリンガー溶液10マイクロリットルに0.3マイクロリットルのセレクチンストック染色液を添加する。次に、メンブレンを、温かい酸素化ヒープ緩衝リンガー溶液で灌流した記録チャンバーに入れます。

マイクロメートルマニピュレーターを使用して、色素の入ったピペットを内側の限界膜に当てます。ピペットをさらに進めて、内側の制限膜を貫通します。次に、染色溶液を1つまたは複数の標的位置に注入します。

次に、組織が注射から回復するまで10分間待ち、それを落射蛍光照明下で観察します。必要に応じて、インサートをガラス底の培養皿に移し、網膜を下にして置きます。試料を湿らせておくために、ヒープ溶液を1滴加えます。

また、プラスチックリングの周囲に真空グリースの3つのスポットを配置して、インサートを培養皿にしっかりと固定します。固定後、ディッシュを顕微鏡ステージに移し、メンブレンをショ糖勾配溶液に浸します。プラスチックインサートリングからメンブレンを切除します。

キムワイプでできるだけ多くの溶液を取り除き、網膜を上にしてパラムに置きます。組織とともにパラフォームをクライオスタットチャンバーに移し、OCT培地を一滴加えます。急速冷凍装置を使用して凍結を加速します。

凍結したサンプルを取り外し、裏返します。次に、余分な凍結OCTを切り取ります.サンプルの周囲に約2ミリメートル、3つの側面と側面からミリメートルを残します。

露出した網膜側をOCTの滴で覆い、付着した領域を空けます。.網膜組織を含む膜を凍結します。.OCTをコールドホルダーリングに一滴垂らします。

凍結したサンプルをすぐにドロップに挿入します。10〜20ミクロンの切片をマイナス19°Cで切断し、温かいポリリジン接着スライド上に置きます。スライドを取り付けたセクションを摂氏41度の加熱プラットフォームに2〜3分間、暗闇の中で置きます。

次に、サンプルを摂氏マイナス20度で保存します。この実験は、網膜血管系を複数の網膜層にまたがる血管の精巧なネットワークとして迅速かつ簡単に特徴付ける方法を示しています。イソセレクチンのボーラスローディングとサルファルミン浸漬標識を組み合わせることで、生体組織を網膜内でほぼ即座に視覚化およびスキャンでき、血管を表層から深層まで標識できます。

比較的拡散性が高いのとは対照的に、SRHはセレクチンが内限膜を十分に透過しません。シナプスタンパク質を標識する際に、従来のパラホルムアルデヒドによる固定に比べてカルビミドによる固定にはいくつかの利点があります。例えば、シナプスマーカーのカルビミド免疫蛍光染色による短期間の固定後などです。IPLのPSD 95は、個々のシナプスを区別することと一致する明るい点状の外観を持っていました。

これに対し、従来のパラホルムアルデヒド固定剤を用いた場合、シナプス成分の同定はあまり明確ではありません。同様の結果は、網膜クライオスタット切片でも得られました。このビデオを見れば、このメンブレンにデリケートな組織をマウントする方法と、プレパレーションOne Masterに細胞化学染色を適用する方法をよく理解できるはずです。

網膜をフィルターに取り付けるのに15分かかります。