非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング

ここでの全体的な目標は、ウイルス誘導遺伝子サイレンシングを使用して、内因性植物のVIGを達成するために非宿主耐性に関与する遺伝子を特定する方法論を実証することです。標的遺伝子は、ニコチアナハママ植物に、標的遺伝子の断片を運ぶイチジクウイルスコンストラクトを接種し、緑色蛍光タンパク質を発現する非宿主病原体培養物を遺伝子サイレンシングした植物の葉に調製し、接種する。次に、暗闇のUV光の下で非宿主病原体の緑色蛍光コロニーを評価します。

非宿主耐性を損なう遺伝子サイレンシング植物を同定するためには、ウイルスベクターのインサートをシーケンシングして標的遺伝子を同定します。全体として、VIXを介したフォワード遺伝子スクリーニングのこの方法論により、研究者は細菌性病原体に対する植物の非宿主耐性に関与する遺伝子を容易に特定できます。短期間で、ウイルス誘導遺伝子サイレンシングを介した前方遺伝学とGFP UV発現病原体を組み合わせて、非ST耐性の原因遺伝子を特定することの重要性に気づきました。

以前は、過応答誘発性細胞死と疾患誘発性細胞死をスコアリングすることで、面倒なフォワード遺伝子スクリーニングを行っていました。したがって、ニコチアナベンの種子は、無土壌の培養土混合物で種子を成長チャンバーで発芽させます。3週間後、苗を個々の鉢に移植し、タバコガラガラウイルスが発生する前に少なくとも2〜3日間温室で育てます。

イチジクベクター接種は、cDNAクローンを含むアグロバクテリウムの凍結茎を徐々に解凍します。無菌条件下でIntv 2つのベクターを、個々のアグロバクテリウム培養物をLuriaに接種します。ベルティアグロプレートは、プレートを摂氏28度で最大2日間インキュベートします。

2つの植物の接種に十分なアグロバクテリウム接種が利用できるように、各クローンに対して4つの複製コロニーを成長させます。TRV 1をLuria berti液体培地に接種します。一晩で培養した培養物を遠心分離機で回収し、細菌を接種、緩衝液に再懸濁し、室温で50RPMのシェーカーで3時間インキュベートします。

遠心分離により細胞を回収した後、光学濃度を測定し、5ミリモルのMES緩衝液pH 5.5に細菌ペレットを懸濁し、次にOD600が0.3のT RV 1細菌培養物を3〜4枚のニコチアナハママ葉の軸側に接種します。つまようじを使用して、それぞれのT RV 2コロニーの接種物で葉を2週間刺します。ブタによる効率的な遺伝子サイレンシングには活発な成長が重要であるため、植物を適切な栄養で低温に維持します。

一例として、この実験ではシュードモナスセンゲPVトマトTワンを使用します。病原体は、G-F-P-U-Vを発現できるプラスミドを運ぶ必要がありますキングのPGE株を成長させる液体、ミリリットルあたり10マイクログラムを補充した培地。リファンピシン50マイクログラム/ミリリットルは、摂氏28度で12時間マイシンすることができます。

遠心分離によって細菌培養物を回収し、暗闇で長波長UVランプを使用して緑色蛍光の存在を確認します。滅菌水で2回洗浄した後、細胞を所望の濃度の滅菌水に懸濁し、OD 600を調整します。次に、それぞれの病原体をターゲットの軸方向に接種します。

遺伝子サイレンシングされた葉は、必要に応じて直径約1.5センチメートルの葉を取り囲みます。複数の非宿主病原体を標的遺伝子でそれらの増殖について同時に試験し、サイレンシングされた植物はまた、閲覧するためのベクターコントロールも含んでいる。2〜5日の間に細菌の増殖を移植します。

接種した葉を暗闇で長波長の紫外線にさらします。必ず皮膚と目の保護具を着用してください。細菌のコロニーを、葉の表面から放出される赤色の蛍光の背景にある葉の軸側にある緑色の蛍光スポットとして監視します。

ポジティブコントロールとして機能する宿主病原体が発する緑色の蛍光を確認します。接種後2〜5日間、毎日病原体の成長を観察します。サイレンシングにより、1つ以上の非宿主病原体が増殖したクローンのリストを作成します。

最初の画面から誤検出を削除します。選択したクローンに対してVIGを繰り返し、再度、遺伝子サイレンシングされた植物の非コスト病原体に対する応答をテストします。選択したクローンにコロニーPCRを使用し、T RVのA TTB oneおよびa TB two primers、two vector、またはクローニング部位をブランキングするプライマーを使用してインサートを増幅します。

PCR産物をarosゲル上で実行し、シングルバンドの増幅を確認します。次に、A TTBプライマーまたはクローニング部位に隣接するプライマーを使用して、T RVの2つのベクターに植物遺伝子インサートを配列決定します。配列を用いて芽球を行い、遺伝子の詳細を同定します。

ニコチアナ中のタバコガラガラウイルスベースのイチジクを使用して多数の遺伝子をサイレンシングするための一般化されたプロトコル。このフローチャートに示されているのが浜名です。遺伝子サイレンシングされた植物の一部は、発育阻害、黄変、光退色などの表現型の変化を示しました。

これらのデータは、植物接種前に暗所で紫外線に曝露された病原体の緑色蛍光と、白色光の下で曝露された同じ葉を接種3日後に移植する病原体の緑色蛍光が対照として示されていることを示しています。この実験では、扁平内でのG-F-P-U-V発現細菌の増殖を追跡します。3 つの非ホスト。

病原体を使用して、野生型の非宿主病原体に感受性の高い遺伝子サイレンシング植物の同定プロセスを実証しました 免疫を持つノンサイレンシングニコチアナハママ植物。これらの病原体は増殖しませんでした。しかし、少なくとも2つの非宿主病原体がNB sgt.One

遺伝子サイレンシング葉で増殖しました。細菌の増殖に関する定量的データは、非ST耐性が損なわれた遺伝子サイレンシング植物を特定するプロセスを示しています。このイチジク媒介フォワード遺伝学アプローチを使用して、ニコチアナハマナの約5, 000の遺伝子を沈黙させ、約1年半の期間にわたって非ST耐性を損なう植物を特定しました。

一例として、このスクリーニングから同定された2つの遺伝子サイレンシング植物における非宿主病原体増殖をここに示す。私たちは、何百もの遺伝子に対してウイルス誘導遺伝子サイレンシングを行い、その後、扁平内の非コスト病原体の増殖を観察してサイレンシングされた植物を評価し、非コスト耐性を解剖する方法を伝えたかったと期待しています。このウイルス誘発性遺伝子を使用することにより、媒介プロトコルをサイレンシングすることにより、約2〜3週間の期間で数百の遺伝子をサイレンシングすることができ、その後、GFP UVで標識された非馬病原体の成長を1日約2〜3時間で評価することができ、約2〜5日間にわたって行われます。