総合蝸牛プロテオームを識別するために、ボトムアップとショットガンプロテオミクス

次の実験の全体的な目標は、さまざまなプロテオミクス技術を使用して、蝸牛感覚上皮から最大数のタンパク質同定を達成することです。これは、成体マウスから蝸牛、感覚上皮を単離し、溶解緩衝液中で超音波処理して第2のステップとしてタンパク質を得ることによって達成されます。ペプチドおよびタンパク質配列のカバレッジを高めるために、全ライセートまたは分画されたタンパク質ライセートに異なる消化戦略が適用されます。

次に、強陽イオン交換や逆相クロマトグラフィーなど、さまざまな分離技術を利用して、質量分析の前にサンプルの複雑さを軽減します。その結果、複数のプロテオミクスアプローチと高分解能質量分析計を用いて、マウス蝸牛感覚上皮の多数の膜タンパク質と可溶性タンパク質が同定されたことが示されています。この手法は、抗体マイクロアレイや二次元ゲル電気泳動などの既存の方法と比較した場合の主な利点として、可溶性タンパク質と膜タンパク質の両方が多数同定されるため、蝸牛プロテオームのデータが増えることです。

この方法は、聴覚障害や涙音障害に関連するバイオマーカーに関する洞察を得ることができますが、年齢や乳がんや肺がんに関連するバイオマーカーの同定など、他のシステムにも適用できます。この方法は、血液などの他の生物学的サンプルの研究にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、哺乳類の内耳から得られる限られたプロテオミクスデータセット、特に、この手順を開始する前に同定された限られた数の膜タンパク質を観察し

出生後30日目のマウスから蝸牛感覚上皮を分離します。1 x リン酸緩衝液で組織を洗浄した後、100 μリットルの溶解緩衝液を組織に加え、ソニックディスパーキングを使用して氷上で30秒間混合物を超音波処理します。各超音波処理の間に氷上で溶解物を1分間冷却し、次にサンプルを合計3回超音波処理します。

セントラは、摂氏4度でGの16,000倍でサスペンションを5分間融合させました。終了したら、消化のために上清を保持します。これに続いて、30 マイクロリットルの蝸牛タンパク質抽出物を直接 30 K スピンフィルターに加え、200 マイクロリットルの 8 モル尿素と Riss HCL 遠心分離機で混合します。

混合物を14, 000倍Gで15分間。終了したら、濃縮液を200マイクロリットルの8モル尿素溶液で希釈し、以前と同じ条件で遠心分離を繰り返します。次に、10マイクロリットルの10 XI otoアセトアミドと90マイクロリットルの8モル尿素溶液をフィルター内の濃縮物に加え、1分間ボルテックスします。

マイクロ遠心分離機の棚にスピンフィルターを置いた後、14、000回Gで10分間の遠心分離の後で暗闇の室温で20分間インキュベートし、エンドプロテアーゼlyCのマイクロリットルあたり0.1マイクログラムで1〜50の酵素対タンパク質比で、混合物を摂氏30度で一晩インキュベートします。終了したら、フィルターユニットに100ミリモル重炭酸アンモニウム溶液の40マイクロリットルを追加し、14、000倍Gで混合物を遠心分離します 10分間 前のステップを繰り返した後、8モル尿素の40マイクロリットルでフィルターユニットを洗浄します。次に、フィルターユニットを40マイクロリットルのミリQ水で2回洗います。

フィルターユニットを100マイクロリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウム溶液で3回洗浄したら、トリプシン1マイクロリットルあたり0.4マイクログラムを1〜100酵素対タンパク質比で加え、混合物を摂氏37度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、フィルターユニットに40マイクロリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウム溶液を加えてトリプティックペプチドを溶出し、混合物を14, 000倍Gで10分間遠心分離します。次に、この手順をもう一度繰り返します。

この時点で、消化されたタンパク質サンプルの50〜100マイクログラムを200 x 2.1ミリメートルの5マイクロメートルの強力な陽イオン交換カラムに注入しますペプチドを分離するには、280ナノメートルでペプチド画分を監視し、2分間隔で画分を収集します。フラクションコレクターを使用して、真空濃縮器でフラクションを乾燥させます。終了したら、液体クロマトグラフィーに使用する準備ができるまで、乾燥した画分を摂氏マイナス80度で保存します。

タンデム質量分析。別のアプローチでは、ゲルフリー分画を使用してタンパク質混合物を分離しました。アセトン沈殿により蝸牛タンパク質上清を脱塩した後、112 マイクロリットルの Milli Q 水に懸濁した脱塩タンパク質に 30 マイクロリットルの 5 x サンプルバッファーを加えます。

次に、1モルDTTを8マイクロリットル加え、混合物を摂氏95度で5分間加熱して、タンパク質ジスルフィド結合を減らします。加熱後、混合物を冷まします。アノードリザーバーに8ミリリットルのランニングバッファーを、サンプル収集チャンバーに150マイクロリットルのランニングバッファーを、カソードリザーバーに6ミリリットルのランニングバッファーを追加します。

この負荷に続いて、3.5〜150キロダルトンの質量範囲を持つ8%トリスアセテートカートリッジを使用して、150マイクロリットルの蝸牛タンパク質混合物をサンプルローディングチャンバーに入れます。ランを開始したら、ピペットを使用して装置上の一時停止間隔ごとにサンプル収集チャンバーからサンプルを採取し、新たに標識したマイクロチューブに加えます。その後、収集チャンバーを150マイクロリットルのランニングバッファーで2回洗浄し、廃棄します。

ゲル遊離画分の1Dゲル電気泳動後。個々のフラクションを30Kフィルターユニットに直接追加します。次に、14, 000回Gで25分間遠心分離した後、トリスHCL中の8モル尿素の200マイクロリットルと各画分を混合し、尿素溶液中の10マイクロリットルの10 XIオトアセトアミドを各フィルターユニットの濃縮物に加え、1分間渦

スピンフィルターをマイクロ遠心分離機ラックに入れた後、サンプルを室温で30分間暗所でインキュベートします。次に、30°Cで一晩インキュベートした後、フィルターユニットに1〜50酵素対タンパク質比のLY Cのマイクロリットルあたり0.1マイクログラムを追加し、スピンフィルターに40マイクロリットルの100ミリモル重炭酸アンモニウム溶液を追加し、前のステップを1回繰り返した後、10分間Gを14,000回Gでサンプルを遠心分離します。 スピンフィルターを100マイクロリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウム溶液で3回洗浄し、最終洗浄後に1マイクロリットルのトリプシン1マイクロリットルあたり0.4マイクログラムを1〜100の酵素とタンパク質の比率で追加します。サンプルを摂氏37度で一晩インキュベートしたら、40マイクロリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウム溶液を加えて各フィルターユニットから三連祭壇画ペプチドを溶出し、サンプルを14, 000倍Gで10分間遠心分離します。

これを繰り返した後、ステップ1で、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法でサンプルを分析します。2つの二重消化手順が使用されました。1回目はトリプシッチ消化で、続いてトリプシンによる2回目の消化を行い、これを強陽イオン交換カラムで18個のフラクションに分画してプールし、ナノ液体クロマトグラフィータンデム質量分析法で分析しました。

1回の液体クロマトグラフィータンデム質量分析を行ったところ、合計1,485個のタンパク質が1%FDRで同定されました。この実験的なアプローチを使用します。同定されたタンパク質のうち、324と258のタンパク質は、それぞれミトコンドリアと細胞膜に分類されました。

2番目の二重消化手順は、lys C消化とそれに続くトリプシン消化で構成されていました。各消化物を個々にロードし、強陽イオン交換カラム上で18種類のフラクションに分離し、ナノ液体クロマトグラフィータンデム質量分析法で分析しました。LY Cおよびトリプシンの消化の結果は1%FDRの3, 503の蛋白質の合計を作り出した。

さらに、605と617のタンパク質は、それぞれミトコンドリアと原形質膜に分類されました。このアプローチにより、膜関連タンパク質IDの数が最も多くなりました。LY Cとトリプシンの重複分析。

画分は、同定されたタンパク質のうち65以上が実験間で共有されていることを示しました。しかし、複製解析では新たに同定されたタンパク質もありました。追加のペプチドとタンパク質は、クロマトグラフィーのわずかな変更によって同定されたため、フラグメンテーションのための異なるペプチドが生まれました。

図示のように、ゲルフリー分画の結果を視覚化するために、銀染色ゲルを調製しました。ここで、ゲルは、各連続画分について分子量を増加させることによるタンパク質分離を示した。したがって、12種類のゲルフリー液体画分を2つの異なる多面消化アプローチを用いて消化し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法で分析しました。

最初の消化アプローチは、ダブルトリプシン消化を使用して実施され、これにより、シングルラン液体クロマトグラフィータンデム質量分析を実行する際に、1%FDRで2,165個のタンパク質が同定されました。この実験では、516と399のタンパク質をそれぞれミトコンドリアと原形質膜に分類しました。2 番目の消化アプローチは、エンドプロテイナーゼ ly C を使用して実行し、続いてトリプシン消化、単回液体クロマトグラフィーを使用して実行しました。

タンデム質量分析により、1%FDRの2, 211タンパク質が同定されました。このアプローチでは、トリプシントリプシンアプローチを使用した場合と同数の膜関連タンパク質が示され、質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子PXD 0 0 0 2 3 1でProteome Exchange Consortiumに寄託されました。この手順を試みる際には、すべてのステップで汚染を避け、タンパク質抽出を行うときは組織を氷上に保ち、タンパク質の分解を避けることを覚えておくことが重要です。