DNBS / TNBS大腸炎モデル：食事脂肪の炎症性腸疾患への洞察とエフェクトを提供

この手順の全体的な目標は、DY ニトロ ベンゼン ゾン酸または DNBS を使用して炎症性腸疾患または IBD を研究するための代替の安価な方法を提供することです。これは、最初に肛門に穏やかに挿入することによりDNBSを直腸内に投与することによって達成されます。第 2 ステップでは、組織学的スクリーニングのために大腸の組織切片を取得し、DNBS チャレンジ組織の骨髄ペルオキシダーゼ活性を評価し、最終的にはダイエット オイルが体重減少と大腸炎に及ぼす影響を巨視的方法と顕微鏡的方法の両方で評価できます。

既存のデキストロン硫酸ナトリウム法に対するこの問題の主な利点は、DNBS法が実施しやすく、安価で、再現性が高いことです。この方法は、IBDの研究分野における重要な質問に答えるのに役立ちます、例えば、IBDの再発におけるストレスとうつ病の役割は何か、または腸の損傷と修復の根本的なメカニズムは何ですかマウスのDNBSの直腸設置のためには、19ゲージの針に1ミリリットルの注射器を取り付けることから始まります。ポリエチレン50カテーテルを装備し、新たに調製したDNBSをカテーテルに吸引します。

次に、麻酔をかけたマウスに涙液ジェルを塗布し、指先で動物の後端に穏やかな圧力を加えて、遠位結腸に存在する便を取り除きます。次に、少量のDNBS溶液を注入して結腸を滑らかにし、挿入を容易にしますが、カテーテルを直腸内に約3〜4センチメートル穏やかに挿入します。カテーテルが所定の位置に配置されたら、100マイクロリットルのDNBSまたは対照動物用の等量の50%エタノールを注入します。

その後、試薬の損失を避けるために、動物の頭を90秒間下に置きます。DNBS投与後、最初の1週間の脱水を防ぐために、0.2%生理食塩水で8%ショ糖水を動物に与えます。実験期間中の体重減少、脱水症、または苦痛について、動物の毎日の状態を注意深く監視することは、目的の時点で意味されます。

DNBSチャレンジ後、安楽死させた動物の腹腔を開き、大腸全体を切除します。次に、腸を縦方向に開きます。肉眼的粘膜潰瘍は、結腸の遠位端から近位約2〜3センチメートルで観察する必要があります。.

実験動物の最大の巨視的損傷部位と結腸のセグメントの近位にある0.5センチメートルの切片を、対照動物の対応する解剖学的位置から収集します。次に、骨髄ペルオキシダーゼ活性を評価するために、1つのコントロールおよび1D NBS処理切片を液体窒素で0.5cm凍結し、他の切片を10%中性緩衝ホルミンで一晩または組織学的分析で固定します。翌朝、ホルマリン固定組織を70%エタノールで洗浄し、カセットに入れて組織学施設に送ってパラフィンに包埋し、組織学的スコアリングのためにヘマチンとエオインで染色します。

次に、光学顕微鏡下で各動物から少なくとも3つの組織切片を採点して、各グループの組織学的損傷スコアを決定しますDNBSチャレンジ組織の骨髄ペルオキシダーゼ活性をアッセイします。まず、骨髄ペルオキシダーゼホモジナイズバッファー中のスナップ凍結コントロール組織および実験組織をホモジナイズして、ホモジナイゼーションバッファー懸濁液の1ミリリットルあたり50ミリグラムの結腸セグメントを得ます。次に、均質化された溶液を1ミリリットルの部分に分注し、10,000倍のgと摂氏4度で2分間遠心分離します。

次に、各アリコートの100マイクロリットルを個々のキュベットに移し、IDE、二塩酸塩、過酸化水素を激しく混合した2.9ミリリットルのPBSを追加します。最後に、分光光度計を使用して460ナノメートルの吸光度を測定します。示したばかりのDNBSによる直腸内チャレンジに続いて。

有意な体重減少は、魚油またはキャノーラ油を補給したラットでは48時間、ベニバナ油を補給したラットでは72時間で観察されます。観察された最大体重減少は、魚油、サプリメントラットでは48時間、ラットでは72時間で発生します。キャノーラ油またはベニバナ油を補給。

体重増加は72時間後に再開し、DNBS投与後5日で、魚油とベニバナ油で処理されたグループは、ベースライン値と同様の体重を示しました。ダイエットオイルを補給し、直腸内エタノールを投与した対照ラットは、5日間の研究期間全体で着実に体重を増やしました。DNBSによる腸の損傷は広範囲に及ぶ可能性があります。

しかし、損傷が最大になる領域は、一般に、ラットでは結腸の遠位6センチメートル、マウスでは遠位3センチメートルに限局しています。より詳細な組織学的評価により、潰瘍の形成、好中球およびリンパ球の浸潤、粘液の枯渇、浮腫を含む広範な上皮損傷が観察されます。これらの炎症と組織損傷の組織学的徴候は、DNBSの挑戦時に3つのダイエット油サプリメントグループすべてで明らかですが、最も深刻な損傷はベニバナ油グループで見られ、次にキャノーラ油グループで見られます。

一方、魚油群のラットは、上皮損傷が最小限で、炎症細胞の粘膜への浸潤が限定的であることを示しています。サンプル間の組織学的損傷の違いを定量化して、グループ間の比較を改善できます。このグラフは、DNBS大腸炎中の3つのダイエット油グループの組織学的損傷スコアを示しています。

hおよびe染色切片で観察されるように、ベニバナ油補充群はキャノーラ油群に続く最大の被害を示します。魚油群は最も被害が少ないですが、特に好中球の炎症性細胞浸潤の程度は、骨髄ペルオキシダーゼ活性アッセイを行うことでさらに調べることができます。組織学的損傷スコアから予想されるように。

DNBS曝露後5日目のラット結腸における骨髄ペルオキシダーゼ活性の評価では、ベニバナ油群で最大の骨髄ペルオキシダーゼ活性が観察された3つのグループすべてで活性の増加が明らかになり、次いでキャノーラ油群と魚油群が続きます。この手順を試みる際には、マウスに軽く麻酔をかけ、開発後にDNBSの投与量を最適化することを覚えておくことが重要です。この技術は、炎症性腸疾患の分野の研究者がIBDの動物モデルで腸の炎症を制御するメカニズムを探求する道を開きました。

DNBSでの作業は非常に危険である可能性があるため、溶液を調製する際には、防護服、手袋、ゴーグル、フェイシャルなどの予防措置を常に着用する必要があることを忘れないでください。