ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

次のプロトコルでは、生体エネルギープロファイルの測定と ヒトの血液単球、リンパ球、好中球、および血小板の酸化バースト応答が実証されます。これは、最初に採取したばかりの血液からバフィーコートと血小板が豊富な血漿画分を収集することによって達成されます。第2のステップとして、不均一な白血球集団は、密度勾配によって単核細胞層と多形核細胞層に分離されます。

次に、純粋な単球好中球およびリンパ球集団をMax Separationによってさらに単離し、細胞外フラックスまたはXF分析のためにプレーティングします。最終的には、単球、リンパ球、血小板のミトコンドリア機能の高感度で再現性のある測定、および単球と好中球の酸素消費率の酸化バーストをXFテクノロジーで測定できます。今日お見せする技術の利点は、患者の血液中にあるすべての主要な細胞を小さな血液サンプルから準備できることです。

これらは血小板と白血球を純粋な不活性化型で、それらのミトコンドリア機能を測定します。これにより、患者のさまざまな病気や状態をリアルタイムで反映できると考えています。この方法は、ミトコンドリア機能に対するライフスタイル、食事、病理学的ストレスの役割など、代謝に関する重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。

このプロトコルは、さまざまな白血球集団および血小板中の細胞生体エネルギー学の単離と決定のための複数の技術を組み合わせています。このステップは、密度勾配と磁気分離に正確なピペッティングが必要なため、非常に重要です。さらに、分画中に細胞集団がどこにいるかに注意する必要があります。

末梢血細胞の単離と細胞生体エネルギー学の分析を、24ウェル細胞外フラックスアナライザーまたはXF24でデモンストレーションします。ただし、この方法は、手順を開始する少なくとも2時間前に、XF 96でも実行できます。XFセンサーカートリッジプローブをXFクラン溶液で水和します。

次に、採取したばかりの全血をGの500倍、室温で15分間、スイングバケットローター付きの遠心分離機でスピンダウンします。トランスファーピペットを使用して、赤血球バフィーコート層の上に1cmの血漿が残るまで、血小板が豊富な血漿を含む最上層を取り除き、後で処理するためにプラズマを室温で脇に置きます。.次に、バフィーコートを滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に移し、白血球を24ミリリットルに希釈します。

次に、基礎RPMIを使用して、3つの15ミリリットルの円錐管のそれぞれに低密度、彼の不透明な1.077を3ミリリットル追加します。次に、5ミリリットルの細いピペットの先端を各チューブの底に入れます。順番に、ゆっくりと高密度の3ミリリットル、彼の不透明な1.119を放出します。

次に、低電力設定で自動ピペットを使用して、層を乱すことなく、希釈した血液の8ミリリットルを各勾配に慎重に追加します。青色の染料が低密度グラジエントに追加され、すべてのグラジエント層を可視化できるようになりました。遠心分離により細胞を分離した後、単核細胞と多形核細胞を滅菌ガラスピペットで他の細胞バンドを乱さずに回収します。

各チューブの単核細胞集団と多形核細胞集団を、各細胞タイプに対して単一の滅菌50ミリリットル円錐管にプールし、両方のチューブに4容量のRPMIを追加します。スピンダウン後、細胞はペレットを1.5ミリリットルのチューブに移し、再ペレットを70マイクロリットルの新鮮なRPMIにBSAを添加して再懸濁します。次いで、抗CD14抗体および抗CD15抗体をそれぞれ単核細胞画分および多形核細胞画分に標識した20マイクロリットルの磁気ビーズを添加する。

各細胞懸濁液を摂氏4度で15分間インキュベートし、次いで各チューブを1ミリリットルのR-P-M-I-B-S-A培地で洗浄し、ペレットを500マイクロリットルのR-P-M-I-B-S-Aに再懸濁する。次いで、細胞懸濁液を個々のR-P-M-I-B-S-A洗浄LSカラムに適用し、各カラムを3ミリリットルのR-P-M-I-B-S-A培地で3回洗浄し、細胞懸濁液の流れとカラム洗浄を滅菌チューブに集めて単球と好中球を単離し、最終洗浄後にカラムを磁場から取り出し、陽性で選択された細胞を5ミリリットルのR-P-M-I-B-S-Aを含む滅菌チューブに溶出させる。リンパ球を単離するために、細胞カラムのフロースルー洗浄画分をペレット化し、細胞ペレットを80マイクロリットルのR-P-M-I-B-S-Aに再懸濁し、細胞を20マイクロリットルのCD61およびCD2 35A抗体で4°Cで15分間インキュベートする。

その後、前と同様に最大分離を繰り返し、リンパ球を封じ込めて血小板を分離し、遠心分離機、予約された血小板に富む血漿を回収し、血漿を除去し、プロスタグランジンI1ミリリットルあたり1マイクログラムを補充した滅菌PBSの5ミリリットルで細胞ペレットを1回洗浄し、2つの新鮮なPBSプロスタグランジンIの2つの緩衝液で血小板ペレットを再懸濁し、分離された単球をプレート化し、 リンパ球、好中球、血小板。まず、細胞をカウントし、XFアッセイ培地で適切な容量にすることで、200マイクロリットルの容量でウェルあたり5番目の細胞の10倍に2.5倍の播種密度を得ることができます。24ウェルのXF細胞培養マイクロプレートに、血小板用の細胞Tを被覆したマイクロプレートで、200マイクロリットルの容量でウェルあたり7個の細胞に10倍の血小板を播種します。

細胞をプレート上に回転させた後、XF培地で最終ウェル容量を最大660マイクロリットルまで取り込み、インキュベーション負荷中にXFアッセイに先立って30分間プレートを摂氏37度でインキュベートし、アッセイ試薬の75マイクロリットルをリストされた順序でXFセンサーカートリッジ注入ポートにインキュベートします。酸化バースト測定を取得する場合は、アンチマイシンの後にPMAを注入し、次の注入ポートをロードしてカートリッジを細胞外フラックスアナライザーに置き、アッセイを開始します。白血球と血小板の生体エネルギープロファイルは、細胞内の酸素消費量を非侵襲的にリアルタイムで測定するタツノオトシゴXF細胞外フラックスアナライザーを使用して決定できます。

各細胞タイプは、表に示されているように、XF 24マイクロプレートに5回の繰り返しでプレーティングされます。アッセイ中に測定された代表的な基礎バースト値および酸化的バースト値、およびウェルあたりの平均タンパク質濃度は、細胞タイプによって実証されます酸素消費率の値は、対応するウェルの総タンパク質含有量に正規化され、タンパク質のマイクログラムあたり1分あたりのpモルとして表されます。基礎酸素消費率は、最初の3つの測定によって確立されます。

ミトコンドリアA TP合成酵素の阻害剤であるオリゴマイシンは、TP合成に結合された酸素消費率を推定するためにXF培地に注入され、残留酸素消費率から非ミトコンドリア酸素消費率を差し引いたTPがプロトン漏れに起因すると考えられる。アンカップリングFCCPを添加することで、最大酸素消費率を決定し、その後、アンチマイシンaとミトコンドリア呼吸阻害剤を注入して、非ミトコンドリアの酸素消費源を測定することができます。予備容量は、エネルギー需要の増加下でミトコンドリアが実行できる追加の作業量の尺度であり、単球と好中球の酸化バースト容量を決定するために、最大呼吸数と基礎呼吸数の差として計算できます。

P-M-A-A-P-K-Cアゴニストを注射し、酸素消費率の増加はN-A-D-P-Hオキシダーゼによる酸化剤産生と関連づけられる 一度習得すれば、この技術は採血後わずか3時間で行うことができ、適切に行われればアッセイ自体は含まない。この手順を試行する際には、生物学的安全キャビネットで各ステップを実行し、滅菌室温の緩衝液と培地を使用して、無菌状態を維持することが重要です。この手順に続いて、細胞の純度、白血球の活性化状態を決定し、白血球亜集団の細胞生体エネルギーを決定するためのファックス分析などの他のプロトコルを行うことができます。

このビデオを見た後、血小板、リンパ球、単球、好中球を準備し、それらをタツノオトシゴに入れ、これらのデータから酸化バーストとミトコンドリア機能を測定する方法について、かなり明確なアイデアが得られるはずです。その後、患者集団を分析し、彼らの生体エネルギーがどのように変化しているかをリアルタイムで判断できます。人間の患者サンプルを扱う作業は非常に危険であることを忘れないでください。

したがって、この手順では、個人用保護具を着用し、生物学的安全キャビネットを使用する必要があります。