コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

次の実験の全体的な目標は、プロテオミクス分析のためにヒトとマウスの脳組織からタンパク質を抽出することです。これは、一般的な溶解バッファーを使用して、2次元電気泳動アプローチに適合した同じタンパク質抽出物を得ることによって達成されます。次に、2次元蛍光差分ゲル電気泳動を使用して、質量分析の同定のためにタンパク質を分離します。

これに続いて、イムノブロッティングを用いた小型2Dゲル電気泳動を行い、翻訳後修飾を同定します。その結果、全体的なタンパク質発現を示すことができます。宿主の翻訳は、等電点と分子量の違いに基づいて、すべての結紮および触媒生成物を変化させます。

2D ダッシュと2D モノロの組み合わせは、発現変化に関する情報を同時に提供することで、神経プロテオミクス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。製品の郵便改変と異化作用 脳組織の採取と均質化から始まります。ヒト脳組織の抽出バッファーで、体積に対して10%の重量で組織を調製します。

ガラスピペッターを使用して組織を均質化しますが、げっ歯類組織用のテフロンホモジナイザーを使用して、いずれかのホモジネートを崩壊させます。30/2秒パルスを使用して60ヘルツで超音波処理します。次に、BSAを標準試料として使用したBradfordアッセイでタンパク質濃度を測定します。

次に、クロロホルムメタノール沈殿の溶液を氷のバケツに集めます。11 cm の IPG ストリップの場合は約 125 マイクログラム、18 cm の IPG ストリップの場合は約 1.25 ミリグラムを収集するように計画します。溶液が摂氏4度になったら、氷上で完全に沈殿します。

まず、メタノールを3容量追加し、次にクロロホルム容量を1容量追加します。この混合物を振る。次に、冷水を3容量加えます。

ボルテックス、この混合物は1分間、サンプルチューブを12、000Gで4°Cで30分間遠心分離します。上清を吸引して捨てます。次に、3容量のメタノールボルテックスを加え、同じ方法でタンパク質をスピンダウンします。

収集したタンパク質ペレットを窒素ガス下で乾燥させてから、2D DIGEにしてください。タンパク質を2Dバッファーに2.5ミリグラム/ミリリットルで懸濁します。次に、サンプルが使用されるまで、前と同じようにサンプルを超音波処理します。

このステップを開始する前とタンパク質沈殿後に摂氏マイナス80度で保存してください。Bradford Assayにより、再度タンパク質濃度を決定する必要があります。サイ色素のラベリング前に示したのと同じ手順に従います。

そのために、タンパク質サンプルの品質はSDSページで確認しています。LDSで15マイクログラムのタンパク質を希釈し、彼はそれを熱浴またはブロックで摂氏37度に希釈します。次に、ポリアクリルアミドゲルにそれらを実行し、ゲルをクマシブルー溶液で少なくとも1時間染色します。

次に、ゲルを7%酢酸、10%エタノール溶液に一晩保持します。タンパク質サンプルの品質が確立されると、翌日からSDの標識手続きが開始されます。まず、ライセートのpHを測定し、これは塩基性から中性である必要があります。

その後の反応に最適なpHは8.6です。次に、各タンパク質サンプルの色素標識反応を設定します。50マイクログラムを400ピコモルのS3染料と混合し、50マイクログラムを400ピコモルのSファイブ染料と混合します。

これを四重鎖で行い、サンプルあたり合計8回のDカップリング反応を行います。試験したサンプルごとに、疾患のある脳などのコントロール由来のタンパク質を使用して、DIカップリング反応の補完的なセットを作成します。次に、反応のペアごとに、CY 2の400ピコモルと、合計250マイクログラムのすべてのタンパク質の均一な表現を使用して、内部制御反応を設定します。

SAI標識は、すべての反応混合物を摂氏4度の暗所で1時間インキュベートすることによって達成されます。インキュベーション後、3つの異なるシアン反応のすべてのセットを150マイクロリットルの容量に結合し、200マイクロリットルの2Dバッファーでの各反応セットに結合します。その後、2D電気泳動のステップに進みます。

まず、各サンプルのタンパク質スポットを切除する調製ゲルとポジティブコントロール用の非標識タンパク質溶液を調製します。300〜350マイクログラムの非標識タンパク質を2Dバッファーに分注し、IPGストリップと接触して再水和させます。次に、IPGストリップをロードし、標識タンパク質と非標識タンパク質を再水和に移します。

次に、各ウェルをIPG反応ストリップで覆います。これに続いて鉱油を重ね、ストリップを摂氏25度以下の状態で一晩中タンパク質溶液と受動的に再水和させます。翌日、IPGストリップの等電点電気泳動を行います。

次に、オイルを取り除き、IPGストリップを摂氏マイナス20度で保管して、IPGストリップを平衡化します。平衡化バッファーに15分間浸漬します。次に、ストリップを平衡化バッファー中の4.7%IDOアセトアミドに移し、ストリップを浸漬している間にDTTが不足しています。

大型の 2D ゲルシステムを使用して、標識タンパク質用の低蛍光ガラスプレートにサンプルあたり 4 枚の 12%SDS ページゲルを注ぎます。また、非標識タンパク質のそれぞれについて、厚さ1.5mmの標準ガラスプレートに12%SDSページゲルを1枚注ぎます。これが分取ゲルです。

ゲルが冷却されたら、ストリップをゲルの上部に移し、冷却したらストリップに0.5%Arosを重ね、ゲルを摂氏4度で2.5ワットで一晩実行し、翌日分析します。多くの2D反応は、分取ゲルに使用したタンパク質サンプルで行うことができます。100マイクログラム未満のサンプルを200マイクロリットルの2Dバッファーに測定します。

次に、サンプル混合物を激しくボルテックスし、すばやく回転させます。サンプルを11cmのIPGストリップにロードし、翌日、鉱油で覆われた一晩中受動的に再水和させます。等電点電気泳動を行います。

次に、ストリップを平衡化バッファーの3つの浴に通して、浴ごとに15分間移動します。その後、ストリップを2D SDSページゲル上で泳動します。各ストリップを適切な分子量のプレキャストゲルに重ねます。

目的のタンパク質用のポリアクリルアミド。その後、ゲルをニトロセルロースPVDFメンブレンに移し、このプロトコルの開発において抗体で分析します。3つの異なる溶解。

バッファーがテストされました。まず、一般的な生化学的および分子生物学的バッファーです。Tris SDSを試験しました。

Tris SDSは、テスト済みの別のバッファUTSと比較して解像度が低かった。de の 3 番目のバッファーは、テスト可能なサンプルを調製できなかったため、除外されました。次に、ヒトとマウスの脳プロテオームを調査しました。

ヒト制御皮質サンプルと広告皮質サンプルを比較しました。また、AD様タウ病理を有するマウスのマウス脳タンパク質もヒト試料から観察した。SCI 2は、各DのS SI 3とsci 5と同様に、独立して見ました。

定性的なミニ2D解析を使用して翻訳後修飾を調査したところ、広告組織中の靭帯化αシヌクレインは正常なプロファイルを持つだけでなく、アスタリスクでマークされた二量体としても見つかりました。アルファシヌクレインが見つかった場所を示す矢印。ユビキチン化アミロイド前駆体タンパク質もmini 2Dで観察しました。

散発的な広告と家族向けの広告を比較しました。家族性広告では、βアミロイド1から42およびISO分散は、liga形態が8キロダルトンで見つかったため、濃度が低くなっています。このビデオを見れば、タンパク質発現修飾を測定して複雑なサンプルを比較するためのプロテオームの研究方法について十分に理解できるはずです。