C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

本手順の全般的な目的は、C型肝炎ウイルス（HCV）の複製サイクルのさまざまな段階を調査することです。まず、線状化したHCVプラスミド構築物からHCVゲノムRNA転写物を生成します。次に、細胞にH-C-V-R-N-Aをトランスフェクションします。その後、さまざまなタイムポイントとアッセイに合わせて細胞を播種します。最終ステップとして、ウイルス価を測定するために細胞培養上清を回収し、タンパク質およびRNAのためにトランスフェクションした細胞を回収します。最終的に、逆転写PCR、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光アッセイ、およびHCVタイターを行い、堅牢なHCV感染細胞培養システムであることを実証します。

この感染性C型肝炎ウイルス（HCV）細胞培養システムの、HCVレプリコンシステムに対する主な利点は、ウイルスの進入、ビリオンの構築、および放出の過程を解析できる点にあります。本プロトコールは、ビリオンの形態形成や宿主と病原体の相互作用など、C型肝炎ウイルス学における重要な課題の解決に寄与します。また、本手法は、ワクチン候補として評価可能な弱毒化ウイルス株の特性解析を可能にするため、ワクチン開発への応用が期待されます。

この手法はC型肝炎ウイルスに関する知見を提供しますが、Flaviviridae科に属する他のRNAウイルスにも適用可能です。一般的に、この手法を初めて行う方は、高品質なHCVゲノムRNAを調製するという課題に直面します。ジェノタイプ2AのHCV日本劇症肝炎1分離株の発見により、細胞培養においてHCVの完全な複製サイクルの研究が可能になりました。このアッセイでは分子生物学的および細胞生物学的手法の両方の専門知識が必要となるため、ウイルス学的アッセイを視覚的に実演することが極めて重要です。

ウイルス複製を評価するために、遺伝子型内2AキメラウイルスF-N-X-H-C-Vおよびpol-null HCVを用い、2 mLチューブ内でXBA-one制限酵素を用いて既作製のウイルスプラスミドを線状化します。その後、プラスミドをムング豆ヌクレアーゼで処理し、平滑末端を生成します。

アニオン交換クロマトグラフィーにより、消化後のプラスミドを精製します。アガロースゲル電気泳動により、線状化プラスミドの完全性を確認します。次に、HCVゲノムRNA転写物を合成するため、T-seven RNAポリメラーゼ反応成分を含む0.2 milliliterチューブに、線状化プラスミドDNAテンプレートを加えます。

RNA精製キットを用いて、新たに合成しDNase処理を施したRNAを精製します。次に、アガロースゲル電気泳動によりRNAの生成を確認します。その後、分光光度法を用いてRNAを定量します。

トリプシン酵素処理を用いてHuh-7由来の接着細胞を剥離し、50 mLコニカルチューブに回収します。その後、2回の遠心分離を行い、細胞ペレットを冷たい低血清培地で再懸濁します。再度遠心分離を繰り返した後、細胞を1 × 10⁷ cells/mLの密度で低血清培地に再懸濁します。

次に、転写されたウイルスRNA合計10 µgと、再懸濁した細胞400 µLを、あらかじめ冷却した0.4 cmエレクトロポレーションキュベットに混合します。270 V、100 Ω、950 µFのエレクトロポレーション条件下で、ウイルスRNAを細胞内に導入します。完了後、エレクトロポレーション後の細胞を15% FBSを含む完全増殖培地10 mLで再懸濁します。この時点で、細胞をT 25フラスコ（1フラスコあたり約1.2 × 10⁶ cells）および48ウェルプレート（1ウェルあたり1 × 10⁴ cells）に播種し、4時間、48時間、96時間のタイムポイントで準備します。トランスフェクションの4〜8時間後に、培地を10% FBSを含む新鮮な補充増殖培地に交換し、培養フラスコおよびプレートから死細胞の残骸を除去します。

セロロジカルピペットを用いて、48時間後および96時間後の時点で細胞培養上清を15 mLコニカルチューブに回収します。次に、回収したサンプルを4°C、15,000 rpmで10分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。遠心分離後、細胞除去後の上清を-80°Cで保存します。

指定したタイムポイントで、ウェスタンブロットおよび逆転写定量PCR（RT-qPCR）によるタンパク質およびRNA解析のために細胞を溶解します。0.2 mLチューブ内で、逆転写酵素と5'非翻訳領域に結合するHCVセンス鎖特異的プライマーを用いて、1 µgの全細胞RNAを逆転写します。また、既知のゲノムコピー数のF-N-X-H-C-V-R-N-Aを、HCVセンス鎖プライマーを用いて同様に逆転写します。リアルタイムPCRシステムを用い、得られたcDNA 50 ng、HCV特異的プライマー、およびDNA結合グリーン色素含有qPCRスーパーミックスを使用してqPCRを行います。H-C-V-R-N-Aコピー数を決定するためのqPCR実行時には、以下の条件を使用してください。qPCR後、ウイルスRNAを導入した96時間後の細胞溶解液をSDS-PAGEで分離します。次に、ゲル内で分離したタンパク質を、Trans-Blot Turbo法によりポリビニリデンフルオリド（PVDF）膜に転写します。5%脱脂粉乳と0.2%Tween-20を含むPBSブロッキング溶液を用いて膜をブロッキングし、容器内に静置します。

4°Cの低温室にて、1/1000に希釈したマウス抗NS3モノクローナル一次抗体および1/5,000に希釈したβ-actin一次抗体でメンブレンをインキュベートします。インキュベーション後、1/5,000に希釈した西洋ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンG（IgG）を加え、化学発光により検出します。

この時点で、免疫蛍光染色のために、H-C-V-R-N-Aをトランスフェクションした細胞をメタノールを用い-20 °Cで30分間固定します。固定後、細胞をPBSで3回洗浄します。免疫蛍光染色用ブロッキングバッファーでブロッキングした後、ウサギポリクローナルanti-NS5A一次抗体とマウスモノクローナルanti-DSRNA抗体J2を1:200に希釈して加え、4 °Cの低温室で5時間から一晩インキュベートします。一次抗体のインキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄します。次に、ヤギanti-rabbit immunoglobulin-G 488ポリクローナル二次抗体とヤギanti-mouse immunoglobulin 594ポリクローナル二次抗体を1:1000に希釈して加え、室温のテーブルトップロッカー上で1時間インキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄した後、Hoechst染料を用いて核を染色し、蛍光顕微鏡で観察します。

次に、96ウェルプレートを用い、1ウェルあたり約3×10³個の未感染Huh7.5.1細胞を播種します。翌日、増殖培地を用いて、HCV RNAをトランスフェクションした細胞から回収した無細胞培養上清を10倍段階希釈し、Huh7.5.1細胞に3ウェルずつ接種します。感染から72時間後、-20°Cで30分間メタノールを用いて細胞を固定します。フリーザーから細胞を取り出した後、前述の条件に従い、HCV NS5Aタンパク質を免疫染色します。蛍光顕微鏡を用いて、ウイルス希釈倍率が最も高いウェルのNS5A陽性細胞フォーカス数をカウントし、1mLあたりの平均フォーカス形成単位（FFU）数を算出します。

線状化したHCVプラスミドの品質をゲル電気泳動により評価した。H-C-V-D-N-AをT7 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写に供したところ、9.6 Kilobasesの単一のRNA産物が得られた。RT-qPCRの結果から、野生型ウイルスはゲノムを効率的に複製することが示された。野生型は、pol-nullウイルスと比較して、ゲノム複製のレベルが1〜3 log高いことを示した。

野生型ウイルスは、ウイルス蛋白質の切断およびゲノム複製に関与するNS3蛋白質を産生しました。また、野生型ウイルスはNS5A蛋白質を発現し、野生型を transfection した細胞の細胞質においてNS5A蛋白質と二本鎖RNAが共局在したことから、ウイルス複製が活性化していることが示唆されました。ウイルスタイターの測定により、野生型ウイルスは感染性を持ち、感染性粒子1 mLあたり10,000個以上の foci forming units を産生することが示されました。transfection の6時間後には、野生型ウイルスと pol-null ウイルスの両方で同様のルシフェラーゼ活性が認められ、transfection されたRNAの導入レベルが同等であり、翻訳されたことが示されました。しかし、transfection の48時間後および96時間後には、野生型ウイルスは pol-null ウイルスと比較してゲノム複製レベルの上昇を示しました。また、野生型ウイルスはウイルスNS3蛋白質を産生しました。pol-null ウイルスは基底レベルのルシフェラーゼ活性を示したのに対し、野生型ウイルスは pol-null レポーターウイルスと比較して2〜3 log高い複製レベルを示しました。C型肝炎ウイルスのウイルス学的アッセイは、習熟し適切に実施すれば2週間で完了させることができます。本手順を行う際は、頑健な細胞と高品質なHCVゲノムRNA転写産物を用いることが重要です。本手順に従い、特性解析されたHCV株を動物モデルシステムで検証することで、in vivo での適応度や宿主と病原体の相互作用を調査することが可能です。

感染性HCV細胞培養システムの開発により、研究者はHCV複製サイクルのビリオン形態形成およびウイルス放出のステップを探索することが可能になりました。このビデオを視聴することで、C型肝炎ウイルス複製サイクルのさまざまな段階を特性評価するための、さまざまなウイルス学的アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。C型肝炎ウイルスの取り扱いは非常に危険であるため、本手順の実施中は、適切な個人用保護具の着用などの安全対策を常に講じることを忘れないでください。