ヒト血清から小非コードRNAの分離
2014年6月19日
このプロトコルは、ヒト血清から低分子RNAを抽出するための方法が記載されている。私たちは、DNAアレイで使用するために、がん血清からマイクロRNAを分離してもシングルプレックス定量PCRするために、このメソッドを使用している。プロトコルは、高品質のRNAを得るために変更を加えてフェノール及びグアニジニウムチオシアネート試薬を利用する。
この手順の全体的な目標は、血清サンプルから高品質のRNAを単離することです。一般的なMRCトライ試薬RTLSプロトコルの最適化バージョンを使用します。これは、まず血清をヌクレアーゼフリー水で1〜5倍に希釈し、タンパク質汚染を低減することで達成されます。
2番目のステップは、最初の遠心分離ステップに2ミリリットルのフェーズロックチューブを導入することです。これにより、フェノールやタンパク質などの汚染物質の大部分が有機相に閉じ込められます。次に、3番目と最後の最適化ステップは、エタノール洗浄の前にRNAペレットから残留汚染を除去する12, 000チーズでのフラッシュ遠心分離スピンです。
最後のステップは、より高い総RNA収量が必要な場合に、同じ患者から2つの修飾RNA調製物をプールすることです。最終的には、ヌクレアーゼフリーの水で血清を可溶化するこの修正方法を使用して、フェーズロックチューブを使用して主要な汚染物質をトラップし、フラッシュスピンを導入します。我々は、血清からのRNA単離から低分子の非コーティングRNAの回収率を最大化することが可能であることを示す。
この手法は、標準的なトリオールRNA単離プロトコルのような既存の方法と比較した場合の主な利点は、簡単な修飾により、血清からのRNAの収量を最大化できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、血清中にsmall RNAが少量含まれているため、苦労します。これらのステップの最適化された方法と視覚化により、これらのRNAの回収率が向上し、初心者が成功した単離Tipに導きます。
まず、事前に調製した凍結血清サンプルを氷上で解凍し、解凍したばかりの血清400マイクロリットルを標識されたマイクロ遠心チューブに移します。次に、血清を100マイクロリットルのR naseフリーウォーターで希釈し、50マイクロリットルのプロテイナーゼKを1ミリグラムあたり1ミリグラムの濃度で添加します。次に、希釈した血清を摂氏37度で20分間インキュベートし、1.5ミリリットルの三試薬RTLSと100マイクロリットルの4つのプロモアノールで完全に可溶化するための適切なタンパク質消化を可能にします。
ホモジネートを短時間反転させ、5秒間ピペッティングを繰り返します。次に、混合物をラベル付きの2ミリリットルの重いフェーズロックチューブに移します。ホモジネートを12, 000GSで摂氏4度で20分間回転させます。
次に、得られた水溶液1ミリリットルを新鮮なDNA低結合チューブに慎重にデカントします。有機物と界面は、位相ロックチューブの白いゲルの下に閉じ込める必要があります。次に、5マイクロリットルのグリコーゲンと500マイクロリットルの100%イソプロパノールを水溶液に加えます。
溶液を反転して混合し、マイナス20°Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベーションに続いて、摂氏4度の遠心分離機で12, 000GSでサンプルを20分間遠心分離します。次に、透明な上清を捨て、摂氏4度の遠心分離機で16, 000GSで2分間フラッシュスピンを行います。
ピペットを使用して、ペレットを囲む透明な溶液を慎重に取り除きます。次に、ペレットを1ミリリットルの70%エタノールで洗浄し、サンプルを10, 000 GSで10分間遠心分離します。ペレットを視覚化するには、暗い背景の前でチューブを傾け、洗浄液をデカンプします。
洗濯を繰り返します。ステップアップ。ペレットを10マイクロリットルのRNAフリー水に懸濁します。
サンプルを摂氏55度で5分間加熱することにより、ペレットが完全に溶解していることを確認します。この間、ピペッティングを繰り返してサンプルを混合すると、同じ患者からの2つのRNA調製物である総RNA収量プールが高くなります。UV対分光光度計を使用して再懸濁RNAを定量
し、2100バイオアナライザーを使用してRNAの品質を評価します。次に、プールしたRNAサンプルをマイナス80°Cで保存し、ダウンストリームアプリケーションで使用できます。ヒト血清由来のRNAのスペクトル光度プロファイルは、従来のチャムチョムスキーアプローチにいくつかのステップを追加することでRNAの収量が向上することを示しています。
ヒト血清から単離されたRNAの典型的なUVプロファイルは、グリコーゲンの添加や余分なスピンなどの最適化ステップを利用したものとは対照的であり、これらの各ツールを組み合わせることで、汚染物質が減少し、総RNA収量が増加します。RNAサンプルの純度は、フェノールとタンパク質をトラップする位相ロックゲルを使用することでさらに増加しました。さらに、血清の量を増やすと、RNAの収量に顕著な影響があります。
サンプルの品質をさらに分析するために、バイオアナライザートレースを実行しました。約 21 ヌクレオチドの 1 つのスパイクは、手順の後に micro RNA フラクションアレイプロファイリングと QPCR が実行されたことを示しています。この3つの頭頸部がんと1つの正常Sのアレイプロファイルは、マイクロRNAの発現を示し、階層的クラスタリングを使用して分析し、マイクロRNAのアップレギュレーションとダウンレギュレーションが見られるヒートマップとして提示されます。
続いて、特定のマイクロRNAについてQPCR増幅曲線を生成しました。このデータは、その後、正常な血清の生のCT値をプロットするために使用されました 一度習得すると、この技術は、手順に従って適切に実行されれば、今日の最大で高品質のRNAを生成する任意の数の患者に対して実行できます。定量的PCRや次世代シーケンシングなどの他の方法を実行して、バイオマーカーの発見や検証などの追加の質問に答えることができます。
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概要
本プロトコルでは、ヒト血清サンプルから高品質なスモールRNAを抽出する方法について説明します。最適化されたこの手順は、DNAアレイや定量PCRなどのアプリケーションに向けてマイクロRNAを単離することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- RNA抽出
背景
- 小型RNAは遺伝子調節において重要な役割を果たしています。
- 正確なダウンストリームアプリケーションには、高品質なRNAの単離が不可欠です。
- 血清サンプルはタンパク質混入があるため、抽出が困難な場合があります。
- RNAの収量と純度を向上させるには、最適化されたプロトコルが必要です。
研究目的
- 血清から小型RNAを抽出するための信頼性の高い手法を開発すること。
- 研究用途におけるRNAの品質を向上させること。
- コンタミネーションを最小限に抑えるプロトコルを提供すること。
使用された方法
- タンパク質混入を低減させるため、ヌクレアーゼフリー水で血清を希釈する。
- 遠心分離時にフェーズロックチューブを使用し、不純物を分離する。
- フラッシュ遠心分離を行い、RNAペレットから残留不純物を除去する。
- エタノール洗浄を行い、RNAを精製する。
主な結果
- 本プロトコールにより、高品質なsmall RNAを正常に単離できる。
- コンタミネーションを最小限に抑えることで、RNAの完全性が向上する。
- 単離したmicroRNAは、さまざまなアッセイに有効に利用できる。
- がん研究における適用性が実証されている。
結論
- この手法は、血清からのRNA抽出のための堅牢なアプローチを提供します。
- 信頼性の高い実験結果を得るためには、高品質なRNAが不可欠です。
- このプロトコルは、さまざまな研究ニーズに合わせて調整することが可能です。
よくある質問
業界における重要性
ヒト血清から高品質な小型非コードRNAを単離することで、腫瘍学およびその他の疾患領域におけるバイオマーカーの探索とターゲットのバリデーションが可能になります。本手法は、血清におけるRNA収量の低さと混入という課題に対処し、初期段階のバイオマーカーアッセイにおける予測信頼性を向上させます。最小限のサンプル量と標準的な実験室試薬を用いることで、本プロトコルはトランスレーショナルリサーチのパイプラインに適した、拡張性と再現性のあるワークフローを支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見とターゲットバリデーション
- 科学的価値：疾患パスウェイにおける潜在的なバイオマーカーまたは治療標的としてのmicroRNA発現パターンの解析を可能にする。
- 運用の価値：ダウンストリームの機能検証に向けて、限られた血清量から十分な量のRNAを得るための信頼性の高い手法を提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： マイクロアレイおよびqPCRアプリケーションに適した高純度のRNAを得ることができ、スモールRNAの発現変化を正確に検出することが可能になります。
- 運用的価値： フェノールやタンパク質などの不純物による変動を低減し、ラン間および施設間でのアッセイの再現性を向上させます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：血清中のバイオマーカー探索から、疾患関連モデルを用いた前臨床検証までの連続性を支援します。
- 運用の価値：ターゲットの優先順位付けに不可欠な、定量可能で完全性の高いRNAデータを提供し、リスクを考慮した意思決定を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は初期探索のプロセスに組み込まれており、リード化合物の最適化に先立つ、仮説に基づいたターゲット同定およびアッセイ開発を支援します。
- 探索生物学：血清から低発現のsmall RNAを回収して発現プロファイリングを可能にすることで、仮説検証を促進します。
- スクリーニング：標準化されたRNAインプットを生成し、マイクロアレイおよびqPCRベースのスクリーニングプラットフォームにおける再現性と感度を向上させます。
- 分析：定量可能なRNA収量および品質指標（例：UVスペクトル、バイオアナライザー波形）を生成し、サンプルの完全性とターゲット結合の客観的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：モデルシステムでの機能アッセイに適したRNAを提供することで、血清ベースのバイオマーカーの知見をメカニズム研究へと結びつけます。
- 組織的な再利用：汎用的な試薬および機器を使用しているため、専門的なインフラを必要とせず、さまざまなチームや施設で適応させることが可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：RNAの分解やコンタミネーションによる偽信号を低減し、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：フェーズロックゲルの使用やフラッシュ遠心分離などの簡略化されたステップにより、スループットと一貫性を改善します。
- 戦略的価値：臨床的に採取可能なサンプルタイプから信頼性の高いデータを提供することで、バイオマーカープログラムにおけるgo/no-go決定を支援します。
- ポートフォリオへの影響：潜在性の高いターゲットの早期特定を可能にし、信頼性の低い候補への投資を削減します。
実施上の考慮事項
- RNAの取り扱いおよび遠心分離技術に関する基本的な分子生物学の専門知識が必要です。
- マイクロ遠心分離機、フェーズロックチューブ、分光光度計を含む標準的な実験設備が必要です。
- ユーザー間で希釈、インキュベーション、洗浄ステップの一貫性を確保するため、標準作業手順書（SOP）による運用が必要です。
- 不純物のプロファイルが異なるため、他の生体試料や組織タイプに適応させる場合は最適化が必要になることがあります。
- 血清中の全RNA濃度が本質的に低いため、回収量が少ない場合には慎重なサンプルのプーリングが必要です。
